代谢工程改造大肠杆菌生产L-高丝氨酸
L-高丝氨酸是一种非必需氨基酸，是合成苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸的重要前体物。L-高丝氨酸虽然不参与蛋白质的合成却是一种重要的功能性氨基酸。作为一种医药中间体，L-高丝氨酸及其衍生物在食品、医药、农业等领域拥有着广泛的市场应用前景。针对于目前关于L-高丝氨酸的合成研究中化学合成法成本高、生物合成法生产效率低的问题，本研究开展了L-高丝氨酸生产菌株的构建研究，具体研究内容和结果如下： （1）弱化降解途径，实现L-高丝氨酸的初步积累。在大肠杆菌中先过表达一个解除反馈抑制的L-高丝氨酸合成途径关键酶编码基因thrAC1034T，再以弱启动子P1，P2，P3替换thrABC操纵子本身的启动子，弱化L-高丝氨酸的降解途径，菌株在基本培养基上正常生长，摇瓶发酵显示菌株H-3的高丝氨酸积累量为1.5g/L。 （2）为强化L-高丝氨酸的合成途径，过表达L-高丝氨酸合成途径关键酶编码基因thrAC1034T。发酵结果显示，双拷贝H-5的高丝氨酸积累量达到了2.6g/L，产量提升了73.3%，而三拷贝菌株H-6产量却只提升了30.7%。 （3）为增加高丝氨酸合成的前体物草酰乙酸的供应，过表达编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的ppc，发酵结果显示菌株H-7高丝氨酸积累量达到了5.8g/L。 （4）为平衡L-高丝氨酸合成途径中辅酶的供应，引入一个来源于枯草芽孢杆菌依赖于NADH的外源谷氨酸脱氢酶编码基因rocG，利用辅助因子自给系统实现NAD+和谷氨酸的再生，为天冬氨酸合成途径提供充足的谷氨酸和NADPH供应，菌株H-8摇瓶发酵L-高丝氨酸产量达到了7.1g/L。 （5）为继续增加辅因子NADPH的供应，分别采用强启动子Ptrc和自身PpntAB启动子增加一个pntAB的拷贝，来促进NADH向NADPH的转化，提升菌株细胞内还原力供应。以自身启动子来过表达pntAB的菌株H-9产量达到了8.8g/L，但是菌株生物量略微降低。 （6）为促进胞内高丝氨酸的外排，分别以高拷贝诱导型质粒pTrc99a(Ptrc)、高拷贝组成型质粒pUC19(Plac)、低拷贝组成型质粒pSTV28(Plac)来过表达具有高丝氨酸外排功能的转运蛋白编码基因rhtA。携带pSTV28-rhtA质粒的菌株H-13摇瓶发酵高丝氨酸积累量达到了12.5g/L，生物量恢复正常水平。 （7）为考察菌株发酵性能，利用5L发酵罐对重组菌株H-13进行分批补料发酵实验。菌株经发酵罐培养48h后，L-高丝氨酸产量为52.1g/L，糖酸转化率为0.43gL-高丝氨酸/g葡萄糖。 本研究构建了一株稳定高产，非诱导、非缺陷型的大肠杆菌L-高丝氨酸生产菌株，研究结果可为生物法合成L-高丝氨酸的研究提供借鉴和参考。
大肠杆菌;高丝氨酸;代谢工程;表达调控
天津科技大学
硕士
轻工技术与工程
张成林
2022
中文
O629.7
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）