代谢工程改造大肠杆菌高效生产N-乙酰神经氨酸
N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）是一种重要的功能性糖，由于其重要的生理功能，被广泛用于食品、医药和其他领域，需求不断上升。目前的生产方法存在一些问题难以解决，如天然产物提取法原料昂贵、化学法分离过程复杂、酶法合成成本高、全细胞催化法操作繁琐等，不利于Neu5Ac的大规模工业化生产。利用代谢工程手段建立稳定、高效的N-乙酰神经氨酸发酵生产体系，是进一步拓展N-乙酰神经氨酸市场的需求。本研究以实验室前期构建的一株N-乙酰神经氨酸生产菌EscherichiacoliNEU-2为出发菌株，从多方面增强前体物磷酸式烯醇式丙酮酸（PEP）的供应，获得了一株N-乙酰神经氨酸高产菌株。主要研究内容如下： （1）强化非PTS系统的葡萄糖摄取效率。在NEU-2的基础上过表达大肠杆菌自身的glk基因，获得菌株NEU-3。摇瓶发酵结果显示，NEU-3摄取葡萄糖的速率和原始PTS系统菌株NEU-0相差无几，且Neu5Ac产量比NEU-2提高了127.88%，达到11.28g/L。 （2）增强中心碳代谢过程中的PEP合成。在NEU-3中单独或组合过表达pps、pck基因，摇瓶发酵结果显示，同时过表达pps、pck基因对提升单位菌体Neu5Ac产量有正向作用。 （3）利用弱启动子微调丙酮酸激酶的表达。将菌株NEU-3的丙酮酸激酶编码基因pykF的天然启动子分别替换成弱启动子BBa_J23103、BBa_J23109和BBa_J23116，得到NEU-8、NEU-9、NEU-10。此外，分别敲除菌株NEU-3的pykF、pykA基因用作对照。最终，敲除pykA的菌株NEU-12以其生产和生长的优势，作为其中微调丙酮酸激酶效果最好的菌株。摇瓶发酵结果显示，NEU-12的Neu5Ac产量增长了18.46%，细胞生长未受到明显损害。 （4）为减少发酵过程中的乙酸积累，本研究从敲除乙酸合成相关基因poxB、ackA和过表达乙酸利用基因acs两种角度出发，以NEU-12为出发菌构建了一系列工程菌。摇瓶发酵结果显示，敲除poxB基因和ackA基因的菌株在发酵过程中乙酸的积累量显著低于对照菌。 （5）重组菌株NEU-12经摇瓶验证有较好的发酵性能，使用5L发酵罐对其分批补料发酵培养。发酵结果显示，菌株NEU-12在5L发酵罐中发酵40h，Neu5Ac产量可达27.41g/L，产量与生产强度超过目前报道的大肠杆菌中最高值。 本研究针对大肠杆菌Neu5Ac合成过程中，前体物PEP供应不足限制目标产物合成效率提升的瓶颈问题，使用代谢工程策略对Neu5Ac生产菌进行合理的改造，最终获得了一株能够高效率合成Neu5Ac的大肠杆菌工程菌，产量和生产强度达到目前报道的大肠杆菌中的最高值。
N-乙酰神经氨酸;大肠杆菌;代谢工程;生物反应器
天津科技大学
硕士
轻工技术与工程
陈宁
2022
中文
TQ921
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）