代谢工程改造大肠杆菌生产肌苷
肌苷是一种多功能嘌呤核苷，参与机体内的物质代谢和能量供应，广泛应用在医药和食品领域。微生物发酵法因成本低廉，能耗较低，环境友好，是肌苷大规模工业化生产的理想方法。随着市场需求量的不断攀升，对肌苷生产菌株提出了更高的要求。为此，本研究以大肠杆菌标准株MG1655为出发菌株，采用CRISPR/Cas9基因编辑方法对肌苷代谢网络进行了系统代谢工程改造，获得了一株稳定高效的肌苷工程菌株。其主要研究内容如下： 首先，依次敲除rihA、rihB、rihC、deoD、ppnP、gsk基因，以阻断肌苷分解途径，构建重组菌株INO1-6。摇瓶发酵结果显示，菌株生长未受明显影响，为肌苷合成效率的提升奠定了基础。 进一步地，引入解淀粉芽孢杆菌的嘌呤操纵子，以强化嘌呤从头合成途径，又过表达解淀粉芽孢杆菌来源的purFbazK316Q突变基因，以解除PRPP转酰胺酶反馈抑制，依次构建重组菌株INO2-6和INO2-9。摇瓶发酵结果显示，两株菌株的肌苷产量分别为155.2mg/L和308.3mg/L。 进一步地，将purA基因替换为枯草芽孢杆菌来源的purAbsuP242N突变基因，以弱化腺苷合成支路，构建重组菌株INO3-4。摇瓶发酵结果显示，在0.3g/L腺嘌呤添加量下，肌苷产量为1412.5mg/L，较直接阻断腺苷支路菌株提高了19.6%。 进一步地，敲除purR基因，以解除prs基因反馈阻遏，又过表达大肠杆菌来源的prsecoD128A突变基因，以解除PRPP合酶反馈抑制，依次构建重组菌株INO4-1和INO4-2。摇瓶发酵结果显示，两株菌株的肌苷产量分别为1.6g/L和3.1g/L，较各自出发菌株分别提高了14.3%和93.8%。 进一步地，过表达解淀粉芽孢杆菌来源的pbuE基因，以增强肌苷的外排，又敲除nupC基因，以减弱肌苷的摄取，依次构建重组菌株INO5-2和INO5-3。摇瓶发酵结果显示，两株菌株的肌苷产量分别为3.9g/L和4.5g/L，较各自出发菌株分别提高了25.8%和15.4%。 最后，利用5L发酵罐对重组菌株INO5-3进行分批补料发酵。发酵结果显示，经48h发酵，肌苷产量为20.2g/L，糖酸转化率为0.12g肌苷/g葡萄糖，生产强度为0.42g肌苷/L/h。该菌株非缺陷型，稳定高效，不含质粒，发酵周期短，为后续工业化应用奠定了扎实基础。
肌苷;大肠杆菌;代谢工程;发酵工艺
天津科技大学
硕士
轻工技术与工程
谢希贤
2022
中文
TQ921;TQ922
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）