L-谷氨酸生产菌的代谢工程理性改造及其发酵控制优化
L-谷氨酸是有机体内氮代谢的基础氨基酸之一，在生命体内物质代谢方面扮演着重要的角色。由于其独特的生理功能，使得谷氨酸被广泛应用于食品、医药等行业，成为了世界上产量最大的氨基酸产品，市场前景广阔。目前，谷氨酸生物素亚适量菌株在发酵过程中存在着产酸量低，糖酸转化率低，菌体易衰老自溶等问题。针对上述问题，本研究以代谢工程理论为依据，以谷氨酸棒杆菌GDK-9(CorynebacteriumglutamicumGDK-9)为出发菌株，进行基因工程改造，同时对其发酵工艺进行开发优化，从而达到提高L-谷氨酸产量及糖酸转化率的目的。主要研究内容如下： 以谷氨酸棒杆菌GDK-9为出发菌株，将外源基因磷酸解酮酶基因—xfp引入到谷氨酸棒杆菌GDK-9中，同时对其与ppc基因表达强度进行优化，缓解了丙酮酸生成乙酰CoA释放CO2，造成碳损失的问题，最终获得基因工程菌GX-4，在5L发酵罐中，L-谷氨酸产量达到了136g/L，提高了18.2%，糖酸转化率为69.4%，提高了3.8%。 为了提高谷氨酸发酵过程中菌体活力和L-谷氨酸产量，针对稀土元素对谷氨酸发酵的影响进行探究，选择La3+、Ce3+和Nd3+三种稀土元素，采用单因素实验和正交实验的方法，得出谷氨酸发酵最佳添加量，在此基础上，对其添加方式进行优化，最终得出稀土元素最佳使用方式为在发酵开始后持续流加10h，流加量为100mg/LLa3+，9mg/LCe3+和0.6mg/LNd3+，发酵结果显示，最大菌体量为56，L-谷氨酸产量为148g/L，分别提高了11.1%和11.3%，糖酸转化率为72.3%，提高了2.9%。 采用全营养流加策略解决L-谷氨酸发酵后期菌体活力不足和产酸能力下降等问题，通过实验分析确定了最佳流加条件为从发酵2h开始流加体积分数为60%的流加培养基，流加时间为24h，经5L发酵罐验证，OD600nm达到了66，提升了29.4%，菌体转型时间由4h提前到了2h；L-谷氨酸产量为168g/L，提高了22.6%，糖酸转化率为72.3%，提高了2.9%。 为了缓解L-谷氨酸发酵过程中由于流加氨水调节pH所带来的NH4+浓度过高抑制菌体活力的问题，提出了氮源双阶段发酵控制工艺。通过实验发现，发酵开始时采用NaOH和氨水摩尔混合比例为1：7的调节液，发酵19h后采用NaOH和氨水摩尔混合比例为1：3的调节液来代替氨水进行pH的调节，提升效果最好。在此条件下，L-谷氨酸产量最终产量为171g/L，提高了11.8%，糖酸转化率也由72.3%提高到了74.1%，对其进行代谢流分析，L-谷氨酸代谢流提高了3.9%。 本研究以代谢工程理性改造为基础，搭配稀土元素添加、全营养流加工艺和氮源双阶段发酵控制工艺，实现了L-谷氨酸产量和糖酸转化率的突破，对于谷氨酸发酵行业的精细化控制和高效产酸具有借鉴意义。
L-谷氨酸;代谢工程;基因工程改造;发酵工艺;糖酸转化率
天津科技大学
硕士
轻工技术与工程
徐庆阳;李志华
2022
中文
TQ922.1
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）