系统代谢工程改造大肠杆菌生产L-亮氨酸
L-亮氨酸属于八大必需的氨基酸之一，具有较高生物学价值和市场需求。当前微生物发酵法生产L-亮氨酸已取得一定进展，但还存在产量低、收率低和发酵周期长等问题。E.coliW3110凭借遗传背景清晰、生长速度快、营养需求简单、操作方便等优势成为底盘细胞，结合代谢工程、基因工程和分子生物学原理，系统理性代谢流分析，最终构建一株L-亮氨酸工业生产菌。研究结果如下： （1）增强前体物的供应。通过突变基因来解除代谢物对乙酰羟酸合酶的反馈抑制，虽发酵液中未检测到L-亮氨酸，但L-缬氨酸有少量积累，说明L-亮氨酸合成代谢流较弱。 （2）强化L-亮氨酸合成途径。已解除反馈抑制的α-异丙基苹果酸合酶编码基因leuACP在pTrc99a质粒被过表达，获得leu2菌株，经摇瓶发酵24h，L-亮氨酸的积累量达到14.7g/L。接下来在pTrc99a-leuACP质粒上整合α-异丙基苹果酸异构酶编码基因leuCD和β-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leuB，获得菌株leu3，经摇瓶发酵，L-亮氨酸的积累量为16.9g/L，比leu2菌株提升14.9％。 （3）促进L-亮氨酸的外排。过表达L-亮氨酸的转运蛋白编码基因yeas，经摇瓶发酵24h，L-亮氨酸的产量较leu3菌株相比，提升了33.3%。同时增加了菌体的生物量，改善菌体的生长。 （4）修饰L-亮氨酸的转氨途径。敲除依赖于NADPH的支链氨基酸转氨酶编码基因ilvE，过表达来自枯草芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶bcdBsu，改变合成过程中对辅酶因子的偏好性。继续过表达bcdBsu，得到菌株leu11。经过24h摇瓶发酵，L-亮氨酸的积累量达到34.19g/L，副产物L-缬氨酸的积累量降低至0.19g/L。 （5）提高丙酮酸的供应。敲除乙酸激酶编码基因ackA，获得菌株leu13，再敲除丙酮酸氧化酶编码基因poxB，得到菌株leu15，继续敲除乳酸脱氢酶编码基因ldhA，构建菌株leu17，经发酵24h，敲除上述基因，对菌体的生物量没有明显影响。L-亮氨酸的积累量相较于菌株leu11相比，分别提高6.88%、12.09%和16.03%。 （6）leu17菌株进行5L发酵罐放大培养，发酵30h时，L-亮氨酸的产量达到最高58.1g/L，糖酸转化率为21%，该菌株是目前生产性能最高的L-亮氨酸生产菌。
大肠杆菌;L-亮氨酸;代谢工程;发酵工艺;微生物发酵法
天津科技大学
硕士
轻工技术与工程
张成林;李志华
2022
中文
TQ921;TQ922
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）