黑曲霉脂肪酶生化特性分析及其分子改造
脂肪酶(三酰基甘油水解酶；EC3.1.1.3)可以催化甘油三酯和其他水不溶性酯在脂质-水界面的水解和合成。目前的研究发现它还可以催化酯合成、酰胺化、醇解、酯交换等一系列反应，并且它们在各种有机溶剂中稳定且不需要辅助因子，是一种多用途的生物催化剂。课题组前期研究中对黑曲霉转录组结果分析，挖掘得到黑曲霉中众多编码脂肪酶的基因，对其酶学性质及分子结构进行深入解析。有助于揭示脂肪酶催化风味物质合成的分子机制。通过定点突变和分子对接研究其脂肪酶催化口袋的结构与功能关系，为脂肪酶蛋白质工程改造提供新思路。 本论文将黑曲霉（AspergillusnigerCBS513.88）来源的两个脂肪酶LipA和LipB在大肠杆菌中成功表达，对两个重组脂肪酶学性质进行进一步研究。底物特异性结果表明，LipA对短中链对硝基苯酚酯（pNPs）有水解活性，对pNP-C4水解活力最强；LipB对中长链对硝基苯酚酯均表现出水解活性,对pNP-C2底物水解活力最高。LipA的最适作用温度和pH为40℃和7.0，40-50℃和pH6.0-8.0条件下有较好稳定性，1mmol/L的Mg2+对LipA的活性有促进作用，Fe3+、乙腈和乙酸乙酯对LipA活性有明显的抑制作用。LipB的最适作用温度和pH为50℃和8.0，在40-60℃和pH5.0-8.0条件下有良好的的稳定性；Mg2+、Ca2+、正己烷和正庚烷对LipB的水解活力有促进作用，Fe3+和十二烷对LipB的酶活力抑制作用最明显。 酯化特性研究表明脂肪酶LipB可以催化乳酸乙酯合成，在乳酸和乙醇摩尔比为1:1的条件下50℃反应12h，乳酸乙酯合成量为54mg/L，该结果为脂肪酶LipB在酿造工业中催化生成风味物质乳酸乙酯的应用做出初步探索。 通过生物信息学分析LipA的二级结构组成，结合同源建模与分子对接模拟不同长度碳链底物与模板蛋白的结合情况，选择6个靠近催化口袋附近氨基酸残基，使用丙氨酸扫描策略得到6个突变体（R116A、Y190A、P241A、C243A、M250A、L253A）。突变酶的稳定性结果表明，M250A的热稳定性提高，C243A的热稳定性下降显著；P241A在酸性条件下的稳定性提高，Y190A在酸性条件下的稳定性降低，而R116A和C243A在碱性条件下的稳定性降低。动力学参数分析结果表明，突变酶的底物特异性均发生改变，其中突变酶Y190A和C243A增强了对中长链底物的特异性，催化口袋及氧阴离子洞附近氨基酸残基的变化会对底物特异性有较大的影响，同时二硫键对酶热稳定性的作用很大。
黑曲霉;脂肪酶;酶学性质;酯化特性;分子改造
天津科技大学
硕士
轻工技术与工程
马立娟
2022
中文
Q556
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）