黑曲霉TNA09基因敲除体系构建
近年来高产柠檬酸工业黑曲霉菌株分子遗传改造技术逐渐引起人们重视，构建高效的遗传操作系统对实现分子改造提升菌株生产性能至关重要。黑曲霉TNA09作为高产柠檬酸的工业生产菌株，由其经多次物理和化学诱变筛选且自身遗传改造可有效利用的标记基因种类少，所以对其进行传统遗传改造十分困难。构建Cre/Loxp、Crispr/Cas9敲除体系实现对相同筛选标记基因的多次利用，甚至完成对多个基因持续敲除，大大提高基因改造的成功率。具体实验内容如下： 本实验构建含由pgH启动ere酶表达的pA1质粒，将该质粒经农杆菌介导侵染pyrg营养缺陷型黑曲霉52-7,得到ere酶异源表达菌株pA1-2,成功将含loxp位点p44-L质粒化转至pA1-2，获得同时表达cre酶和loxp位点的菌株pA1-H6。利用影印法对PA1-H6进行高糖诱导敲除，启动子激活下游cre酶的表达，获得删除hyg抗性的突变株黑曲霉pA1-△hyg-28,初步实现Cre-Loxp系统的构建。为验证Cre-Loxp体系在工业黑曲霉菌株中的可行性，再次将含loxp序列及异源表达irre的pI1质粒化转至pA1-△-28,成功获得irre-11菌株，重复上述诱导实验获得敲除hyg菌株irree-11-48,证明Cre-Loxp系统在工业黑曲霉中切实可行，该体系为筛选标记重复利用提供基础，为进一步实现柠檬酸高产创造条件。 近年来利用黑曲霉菌株进行生产的过程得到众多关注，但微生物仍面临多种极端环境胁迫的压力，如高糖、高温、氧胁迫等，这些对细胞生理活性有重要影响，大大影响生产过程。探究异源表达全局转录因子irre的irre-11-48在极端条件下的生长状况，发现42℃高温下发酵产酸量未受温度影响大幅下降，孢子萌发率较TNA09提高42.27%，具有较强耐热性，对TNA09irre-11-48进行摇瓶发酵产柠檬酸研究并测定24h、48h、60h菌株耐受性相关基因irre、hsp70、cpeB、cam相对表达量，发现出发菌株TNA09的irre基因表达量为0，而异源表达菌株在24h表达量最高，24h热激后hsp70表达量是未热击之前的10倍左右，热休克蛋白提高了细胞的抵抗力起到应激保护作用，cpeB基因表达量24h处达峰值与平板观察实验结果相对应，即菌丝生长初期抗氧胁迫能力最强，cam基因表达量24h最高，是因为irre对转化子Ca2+浓度影响进而对cam蛋白表达影响，主要发生在发酵前期菌丝生长阶段，进而影响irre-48菌株产酸，使电镜观察下菌丝球较TNA09更致密，再次证明异源表达irre基因对提高菌株耐受性的重要影响。 该试验成功构建黑曲霉TNA09原生质体介导转化法，实现工业菌株的基因工程操作。其中最佳原生质体制备和再生的条件：取在CM斜面培养5d的新鲜孢子约1×108个至100mL马铃薯葡萄糖肉汤（potatodextrosebroth,PDB)液体培养基，37℃、180r/min摇床培养17h,取幼嫩菌丝0.70g至1.50%裂解酶+0.50%蜗牛酶+0.20%溶菌酶的复合酶体系中，37℃处理3.25h,该条件下90%~100%释放原生质体，同时再生率可达36%,并利用聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG)-CaCl2介导的原生质体转化方法一次将黑曲霉cexA基因敲除，为后续的柠檬酸工业菌株的分子改造奠定了坚实基础。
黑曲霉;TNA09基因;PEG介导转化;柠檬酸
天津科技大学
硕士
轻工技术与工程
王德培;周昊
2022
中文
TQ921
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）