Tyr和Cys联合刺芒柄花素对冷刺激小鼠肝脏脂质代谢的影响
畜禽遭遇冷刺激易导致生长缓慢、生产性能下降和饲养效率降低等问题。有研究发现，肉羊冷刺激2小时后心率升高，4小时后呼吸频率降低，12小时后直肠温度开始下降。脂质是低温环境下畜禽重要的能源物质，冷刺激条件下动物机体主要以消耗脂类来维持正常代谢功能。肝脏是机体调节脂质代谢的中枢器官，在低温环境下为畜禽提供能量以维持各项生理进程的有序发生。冷刺激条件下紧急的能量动员易导致线粒体功能障碍，维持健康的线粒体网络是保障机体物质代谢的前提。线粒体自噬是线粒体质量控制系统的关键环节，可以清除受损的线粒体来维持线粒体健康。本实验室前期研究发现酪氨酸（Tyrosine,Tyr）和半胱氨酸（Cysteine,Cys）作为成熟的饲料添加剂，在冷刺激条件下可以促进脂肪组织和肝脏组织脂质代谢，提高机体能量代谢水平；刺芒柄花素（Formononetin,FMN）是一种从不同植物中提取的异黄酮类化合物，实验室前期研究还发现FMN与Tyr、Cys协同作用促进机体脂质代谢。目前对于冷刺激条件下Tyr和Cys联合FMN在肝脏脂质代谢过程中发挥的生物学作用尚未明确。因此本研究将线粒体自噬作为研究靶点，旨在探究冷刺激条件下Tyr和Cys联合FMN对肝脏脂质代谢的影响，为提高动物机体的低温适应性提供行之有效的措施方案。 为初步探索Tyr和Cys联合FMN对肝脏脂质代谢的影响，本研究在4周龄雄性C57BL/6小鼠的日粮中添加3％Tyr和Cys的基础上给小鼠灌胃FMN，共处理4周，灌胃结束后采集肝脏组织。利用甘油三酯（TG）试剂盒、总胆固醇（TC）试剂盒、HE染色和油红O染色检测小鼠肝脏组织中TG和TC含量的变化。结果显示，Tyr和Cys联合FMN导致小鼠肝脏组织中TG和TC含量、脂滴数量显著减少。利用WesternBlot技术检测小鼠肝脏组织脂质代谢相关蛋白的表达，结果发现，与对照组（Control）相比，Tyr和Cys联合FMN导致小鼠肝脏组织中脂质合成相关蛋白（FASN、ACC1、SREBP-1c）的表达水平显著升高，脂质分解相关蛋白（PGC-1α、CPT1A、ACOX1、PPAR-α）的表达水平极显著升高。上述结果说明Tyr和Cys联合FMN增加了小鼠肝脏组织对TG和TC的利用。 为确认冷刺激条件下Tyr和Cys联合FMN对肝脏脂质代谢的影响，本研究选取4周龄雄性C57BL/6小鼠在4℃人工气候室中处理3小时，共处理4周；同时在小鼠日粮中添加3%Tyr和Cys的基础上给小鼠灌胃FMN，灌胃结束后采集肝脏组织。利用TG和TC试剂盒、HE染色、油红O染色、WesternBlot对各组小鼠肝脏组织中脂质代谢、线粒体呼吸链复合物以及线粒体自噬相关指标进行检测。结果显示，与冷刺激组（CE）相比，amp;nbsp;冷刺激条件下Tyr和Cys联合FMN导致小鼠肝脏组织中TG和TC含量下降，脂滴数量减少，脂质合成相关蛋白（FASN、ACC1、SREBP-1c）的表达水平显著降低，脂质分解相关蛋白（PGC-1α、CPT1A、ACOX1、PPAR-α）的表达水平显著升高，这些结果表明Tyr和Cys联合FMN通过促进肝脏组织对TG和TC的利用。WesternBlot结果显示，冷刺激导致小鼠肝脏组织线粒体功能障碍，并诱导了PINK1介导的线粒体自噬发生。另外，冷刺激条件下Tyr和Cys联合FMN导致小鼠肝脏组织线粒体功能出现适应性增强，PINK1的蛋白表达水平显著升高且促进线粒体自噬的发生。上述结果表明冷刺激条件下Tyr和Cys联合FMN通过促进PINK1介导的线粒体自噬途径来清除受损的线粒体，以维持健康的线粒体网络。 为验证FMN对PINK1介导的线粒体自噬的调控作用，本研究利用羰基氰化物间氯苯腙（carbonylcyanidem-chlorophenylhydrazone,CCCP）构建AML12细胞线粒体自噬模型，并使用FMN进行时间梯度处理。利用CCK8筛选CCCP和FMN的最适浓度和作用时间，利用Westernblot检测线粒体功能和线粒体自噬相关蛋白的表达变化，利用JC-1荧光探针、Mito-SOX染色和免疫荧光染色检测线粒体膜电位、Mito-ROS、自噬通量和LC3与线粒体外膜定位蛋白（TOMM20）的共定位。细胞实验结果显示，与Control组相比，CCCP处理导致AML12细胞线粒体膜电位下降，Mito-ROS产生增多，线粒体功能受损，并诱导PINK1介导的线粒体自噬发生。与CCCP组相比，FMN处理缓解了CCCP诱导的AML12细胞线粒体功能障碍，减少Mito-ROS的生成，并通过促进AML12细胞PINK1介导的线粒体自噬途径来清除受损的线粒体，进而维持线粒体功能。为验证Tyr和Cys联合FMN对PINK1介导的线粒体自噬的调控作用，本研究利用CCCP构建AML12细胞线粒体自噬模型，并使用Tyr和Cys联合FMN刺激AML12细胞，利用Westernblot检测线粒体自噬相关蛋白的表达变化，结果显示CCCP诱导下Tyr和Cys联合FMN处理促进AML12细胞PINK1介导的线粒体自噬。 综上所述，冷刺激条件下Tyr和Cys联合FMN通过促进PINK1介导的线粒体自噬来维持线粒体功能，增强小鼠肝脏组织中脂质分解相关蛋白的表达，降低脂质合成相关蛋白的表达，继而增强肝脏组织对TG和TC的利用，提高机体能量代谢水平，以补偿冷刺激引起的能量损失，维持机体代谢稳态。
畜禽养殖;冷刺激;刺芒柄花素;酪氨酸;半胱氨酸;脂质代谢
黑龙江八一农垦大学
硕士
基础兽医学
李士泽
2023
中文
S852.2
2023-08-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）