黑水虻抗菌肽HI-3对HCT-8细胞谷氨酰胺-谷氨酸代谢通路影响的研究
目的:黑水虻是双翅目水虻科重要的资源昆虫，其抗菌肽的研究备受青睐，但多集中在抑菌活性方面，关于其抑癌作用报道还相对较少。课题组前期研究表明，黑水虻抗菌肽HI-3可以有效诱导人结肠癌HCT-8细胞凋亡，其凋亡与ROS水平增加相关。本文将利用代谢组学技术进一步研究HI-3对HCT-8细胞代谢组学的影响及可能的调节机制，从新的视角寻找黑水虻抗菌肽在结肠癌治疗中可能存在的代谢靶点及相关代谢通路，为后期黑水虻抗菌肽在结肠癌治疗中的应用提供实验数据和理论支持。 方法:采用CCK-8法筛选黑水虻抗菌肽HI-3对HCT-8细胞代谢组学影响的有效实验浓度；利用GS-MS技术对HI-3作用后的HCT-8细胞代谢产物进行测定，并采用多元统计分析，找出差异代谢产物，分析影响最显著的差异代谢通路，筛选出代谢靶标酶；收集代谢差异最显著的细胞，针对筛选出的代谢靶标酶分别利用酶活性试剂盒检测其酶活性、qRT-PCR技术和WB技术检测其mRNA表达和蛋白表达，并分析其差异性；利用生化试剂盒和ELISA试剂盒检测受影响最显著的代谢通路所涉及的重要代谢指标。 结果: （1）在80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL实验浓度下，HI-3对HCT-8细胞的抑制率分别为33.85±3.45％、46.26±0.87%、55.53±1.69%，且此系列浓度的HI-3对人正常结直肠粘膜FHC细胞无显著影响（P＞0.05）。因此，确认此三种浓度为后续代谢组学研究的实验浓度； （2）利用GC-MS技术筛选得到的差异代谢通路主要有4条，分别为谷氨酰胺和谷氨酸代谢通路，精氨酸和脯氨酸代谢通路，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路，以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路。其中，谷氨酰胺和谷氨酸代谢通路为差异最为显著的代谢通路，并进一步筛选出该通路的代谢靶标酶为GLS； （3）GLS酶活性检测研究表明，在320μg/mL实验浓度下HCT-8细胞内GLS活性显著低于对照组的GLS活性（P＜0.01)，qRT-PCR和WB检测结果亦表明其mRNA和蛋白表达水平与对照组相比均显著降低（P＜0.01）； （4）当HI-3处理浓度为320μg/mL时，HCT-8细胞内谷氨酰胺和谷氨酸代谢通路中重要代谢物Gln、Glu、α-KG及其涉及到的代谢产物GSH和ATP与对照组相比均显著减少（Gln,P＜0.05;Glu,P＜0.01;α-KG,P＜0.05;GSH,P＜0.01;ATP,P＜0.01）。 结论： （1）黑水虻抗菌肽HI-3可显著抑制人结肠癌HCT-8细胞的增殖，对人正常结直肠粘膜FHC细胞无显著影响； （2）黑水虻抗菌肽HI-3可引起人结肠癌HCT-8细胞氨基酸代谢的改变，影响最为明显的代谢通路为谷氨酰胺和谷氨酸代谢通路，其代谢靶标酶为GLS； （3）黑水虻抗菌肽HI-3可能通过阻碍谷氨酰胺和谷氨酸代谢通路，影响其细胞氧化还原稳态和能量代谢，进而实现对人结肠癌HCT-8细胞的抑制作用。
结肠癌;黑水虻;抗菌肽;细胞代谢组学;谷氨酰胺;谷氨酸
遵义医科大学
硕士
免疫学
夏嫱
2020
中文
R735.3
2023-07-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）