抗癌肽SE37的改造及对肿瘤细胞A549和HCT-8的抑制作用及机制研究
目的：分析抗菌肽SE37的抗肿瘤活性，并对其进行序列改造，以期得到抗肿瘤活性更高且毒性较低的抗癌肽（AnticancerPeptides,ACPs）；最后针对抗肿瘤效果好的多肽，尝试探讨相关抗肿瘤机制。 方法：（1）采用MTT法检测SE37对4种肿瘤细胞和正常细胞HK2的增殖抑制作用。（2）以SE37为初始多肽，采用氨基酸替换或肽链截短等方法产生系列多肽。（3）采用固相合成法合成SE37及系列改造多肽。（4）采用MTT法检测系列多肽对4种不同肿瘤细胞和正常细胞HK2的增殖抑制作用。（5）采用AV-PI双染法检测系列多肽对A549和HCT-8凋亡的影响。（6）利用JC-1试剂盒和ROS检测试剂盒检测系列多肽对A549和HCT-8细胞线粒体膜电位和活性氧ROS含量变化的影响。（7）通过荧光定量PCR法检测系列多肽对A549和HCT-8凋亡相关基因表达的影响。（8）通过WesternBlot检测系列多肽对A549和HCT-8凋亡相关蛋白表达的影响。 结果：（1）SE37对A549、HCT-8、SKVO3和MCF-74种肿瘤细胞的生长具有良好的抑制作用，且呈浓度依赖性。其IC50值分别为5.993±0.490、3.293±0.854、4.444±0.750和6.701±0.352μM。此外，它对正常细胞HK2也具有抑制作用，IC50值为6.931±0.214μM。 （2）通过对SE37一级结构序列进行氨基酸替换或肽链截短得到10条多肽。在检测浓度范围内（0~10μM），这些多肽对4种肿瘤细胞的抑制作用呈浓度依赖性。其中，M2和FL15-3两种多肽对A549的IC50值分别为6.423±0.403和10.311±0.270μM，治疗指数为2.321和3.203。RL25-2和FL15-3两种多肽对HCT-8的IC50值分别为3.003±0.413和2.935±0.468μM，治疗指数达到4.337和10.413。RL25-2和FL15-3多肽对SKVO3的IC50值为1.912±0.239和3.066±0.053μM，治疗指数达到6.786和10.826。RL25-1和FL15-3多肽对MCF-7的IC50值分别为4.635±0.252和4.745±0.185μM，治疗指数达到4.563和6.994。 （3）经SE37处理24h的A549细胞发生了明显的细胞凋亡，其细胞内线粒体膜电位与对照相比极显著降低（P＜0.01）；细胞内ROS含量与对照相比极显著上调（Plt;0.01）；促凋亡因子Bax在mRNA和蛋白质水平的相对表达量与对照组相比均显著上调（P＜0.05），抗凋亡因子Bcl-2虽然在mRNA水平的相对表达量与对照的差异不显著（P＞0.05），但在蛋白质水平的相对表达量与对照相比显著下调（P＜0.05）；而凋亡因子Caspase-3和Caspase-9mRNA的相对表达量均无明显变化（P＞0.05）。 （4）经M2处理24h的A549细胞发生了明显的细胞凋亡，其细胞内线粒体膜电位与对照相比极显著降低（P＜0.01）；细胞内ROS含量与对照相比极显著上调（Plt;0.01）；促凋亡因子Bax在mRNA和蛋白质水平的相对表达量与对照组相比均显著上调（P＜0.05）；抗凋亡因子Bcl-2虽然mRNA水平的表达变化不显著（P＞0.05），但其蛋白质水平的相对表达量与对照相比显著下调（P＜0.05）；而凋亡因子Caspase-3和Caspase-9在mRNA水平的相对表达量均无显著变化（P＞0.05）。 （5）经SE37处理24h的HCT-8细胞发生了明显的细胞凋亡，其细胞内线粒体膜电位与对照相比显著降低（P＜0.05）；细胞内ROS含量与对照组相比显著上调（Plt;0.05）；促凋亡因子Bax在mRNA水平的相对表达量变化不显著（P＞0.05），而在蛋白质水平的相对表达量与对照相比显著下降（P＜0.05）；抗凋亡因子Bcl-2在mRNA和蛋白质水平的相对表达量变化均不显著（P＞0.05）；凋亡因子Caspase-3和Caspase-9在mRNA水平的相对表达量均无显著变化（P＞0.05）。 （6）经RL25-2处理24h的HCT-8细胞发生了明显的细胞凋亡，其细胞内线粒体膜电位与对照相比极显著降低（P＜0.01）；细胞内ROS含量与对照相比极显著上调（Plt;0.01）；虽然促凋亡因子Bax在mRNA水平的相对表达量与对照组相比均显著上调（P＜0.05），但其在蛋白质水平的相对表达量并无显著变化（P＞0.05）；抗凋亡因子Bcl-2在mRNA和蛋白质水平的相对表达量变化均不显著（P＞0.05）；凋亡因子Caspase-3和Caspase-9在mRNA水平的相对表达量均无显著变化（P＞0.05）。 （7）经FL15-3处理24h的HCT-8细胞发生了明显的细胞凋亡，其细胞内线粒体膜电位与对照组相比极显著降低（P＜0.01）；细胞内ROS含量与对照组相比极显著上调（Plt;0.01）；促凋亡因子Bax在mRNA水平的相对表达量与对照组相比显著上调（P＜0.05），而在蛋白质表达水平的相对表达量与对照组相比显著下调（P＜0.05）；抗凋亡因子Bcl-2在mRNA和蛋白质水平的相对表达量变化均无显著变化（P＞0.05）；凋亡因子Caspase-3在mRNA水平的相对表达量与对照相比显著下调（P＜0.05）；凋亡因子Caspase-9在mRNA水平的相对表达无显著变化（P＞0.05）。 结论：（1）本课题通过对SE37进行改造得到一系列多肽，其中M2对A549抗肿瘤活性基本不变，但对正常细胞HK2的毒性降低，治疗指数有较明显提升。RL25-2和FL15-3在保持对HCT-8细胞具有强烈的抗肿瘤活性的同时，显著降低了对HK2细胞的抑制作用，治疗指数大幅度提升。以上三条经过改造的ACPs成药性均获得提高。（2）对于A549细胞，SE37和M2可能通过线粒体凋亡途径发挥其抗肿瘤作用。（3）对于HCT-8细胞，SE37、RL25-2和FL15-3均可导致其细胞凋亡，但似乎并没有通过线粒体凋亡途径和Caspase凋亡途径发挥作用，具体的作用机制需进一步探索。
肺癌;结直肠癌;抗癌肽;细胞凋亡;抗肿瘤机制
遵义医科大学
硕士
生物化学与分子生物学
杨愈丰
2020
中文
R734.2;R735.3
2023-07-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）