积雪草苷通过p53信号通路对氧化损伤脐静脉内皮细胞的保护作用及机制研究
目的：观察积雪草苷(Asiaticoside,AC)对叔丁基过氧化氢(tert-butylhydrogenperoxide,t-BHP)诱导的人脐静脉内皮细胞（HumanUmbilicalVeinEndothelialcells,HUVECs）氧化应激水平及p53信号通路的影响，探讨AC对血管内皮氧化损伤的保护作用及其分子机制。 方法： 1.HUVECs采用包括6％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/mL链霉素在内的完全内皮细胞培养基进行培养，并放于37℃含5%CO2、95%O2的无菌培养箱中进行孵养。细胞氧化损伤模型以50μMt-BHP作用12h而建立，接着用25、50、100μMAC进行干预，观察AC对被损伤的HUVECs细胞的保护作用。采用CCK-8法检测不同浓度AC预处理组细胞细胞增殖情况、t-BHP损伤剂量关系以及细胞活性、衰老相关的β半乳糖苷酶（SA-βG）染色进行细胞衰老的鉴定、试剂盒测定细胞上清液中谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathionperoxidase,GSH-Px）活性、一氧化氮（Nitricoxide,NO）含量、细胞中超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase,SOD）活性、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）水平。 2.采用逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测AC抗t-BHP诱导HUVECs氧化损伤中p53信号通路p53、Bax、Bcl-2、Caspase-3的mRNA表达情况，同时Westernblotting法检测p53、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达。 3.采用p53抑制剂pifithrin-α（PFT-α）(30μM)预处理HUVECs，再用50μMt-BHP诱导HUVECs衰老，同时应用100μM的AC处理24h后，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况，qRT-PCR检测Bax、Bcl-2的mRNA表达情况，Westernblotting法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。 结果： 1.CCK-8筛选出t-BHP最佳给药浓度是50μM，与阴性对照组比较，各组AC（3.125μM，6.25μM，12.5μM，25μM，50μM，100μM，200μM）对细胞的增殖能力影响不同，高剂量（如50μM，100μM）预处理24h时可以在一定程度上促进细胞的増殖能力（Plt;0.01）。不同浓度的AC可显著对抗t-BHP造成的HUVECs损伤，与模型组比较，AC组SA-β-gal染色阳性细胞数随浓度的增高而减少（Plt;0.01），且AC浓度为100μM时阳性细胞数最少；与模型组比较，AC组MDA含量降低，SOD活性增强，NO释放量增加，GSH-Px活性升高（Plt;0.05）。 2.与模型组比较，AC组下调p53、Bax、Caspase-3mRNA及蛋白水平（Plt;0.05），上调Bcl-2mRNA及蛋白水平（Plt;0.05）。 3.与阴性对照组相比，t-BHP处理后p53的表达显著增加（Plt;0.01）；与AC组比较，PFT-α预处理后PFT-α+AC组显著降低细胞凋亡率（Plt;0.01）；并显著降低Bax/Bcl-2相对mRNA及蛋白水平比例（Plt;0.01）。 结论：AC可保护t-BHP诱导的HUVECs的氧化损伤，初步证明与p53信号通路活化有关。
积雪草苷;人脐静脉内皮细胞;氧化应激;p53信号通路;叔丁基过氧化氢;细胞凋亡
遵义医科大学
硕士
生药学
聂绪强
2020
中文
R284
2023-07-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）