P450PL2催化烯烃不对称环氧化分子改造的研究
目的：针对P450单加氧酶不对称环氧化的活性分析建立高通量筛选方法，结合蛋白质分子改造技术，筛选获得不对称环氧化活性和立体选择性提升的P450单加氧酶突变体，优化其催化环氧化反应条件，再对底物普适性进行考察，建立P450单加氧酶催化烯烃不对称环氧化的高效生物催化合成路线。 方法： （1）以苯乙烯为模板底物，筛选实验室保藏的重组P450菌株，获得催化环氧化性能优良的P450单加氧酶重组菌，作为定向进化亲本酶。 （2）筛选可高效催化SCN-进攻环氧苯乙烷环氧开环的卤醇脱卤酶（HHDH），通过P450环氧化-HHDH环氧开环级联建立基于SCN-比色分析的高通量筛选策略，用于P450酶环氧化活性的筛选。 （3）以目标P450酶基因为模板，采取随机突变和迭代饱和突变策略构建突变体文库，筛选活性提升的优良突变体；在此基础上，进一步通过半理性设计和CAST（CombinatorialActive-siteSaturationTest）迭代饱和突变策略，筛选立体选择性提高的优良突变体。 （4）构建优良P450酶突变体与葡萄糖脱氢酶（GDH）共表达系统，建立NAD(P)H辅酶循环，在整细胞催化水平上优化反应条件，再进一步考察多种烯烃不对称环氧化的底物普适性。 结果： （1）通过重组P450酶的筛选，获得P450PL2-FdR-Fdx2（P450PL2-2）重组菌，其可催化4mM苯乙烯以43.1±1.25％的产率和(R)-91.7±0.02%的ee值得到产物环氧苯乙烷。 （2）通过HHDH的筛选，获得HheD6可高效催化SCN-进攻环氧苯乙烷发生开环反应；将P450PL2-2催化苯乙烯不对称环氧化反应与HheD6催化SCN-开环反应级联，建立基于SCN-比色的高通量筛选方法，其变异系数（CV）为3.2%，可用于P450环氧化活性的快速分析。 （3）通过随机突变筛选，获得突变体P450PL2-2T179A（P450PL2-SM3），在催化浓度为4mM的苯乙烯苯时，与P450PL2-2相比产率由43.1±1.25提升至62.7±0.7%，ee值由(R)-91.7±0.02%提升至(R)-95.2±0.0%；通过优化反应条件将产率提升至73.3±0.3%，ee值提升至(R)-96.6±0.0%；以突变体P450PL2-SM3为亲本酶，通过理性设计，以CASTing筛选策略进行筛选，获得立体选择性改良的突变体P450PL2-2T179A-P300S（P450PL2-DM3），其催化苯乙烯不对称环氧化的ee值由(R)-96.4±0.1%提升至(R)-98.0±0.0%，但其产率下降至60.0±2.0%。 （4）通过将GDH2分别引入突变体P450PL2-SM3和P450PL2-2重组菌株，获得重组P450PL2-SM3-GDH2（P450PL2-SG）和P450PL2-2-GDH2（P450PL2-G）工程菌，在催化浓度为10mM的苯乙烯时，P450PL2-SG的产率为75.7±2.4%，与P450PL2-G相比产率提升2.88倍，再与前宿主P450PL2-SM3相比产率提升2.73倍。 （5）通过优化P450PL2-SG的催化条件，在催化浓度为10mM的苯乙烯时，发现P450PL2-SG的最佳反应pH为7.0，最佳反应温度为15℃，产率由30℃的4.6±1.3%提升至15℃的72.8±1.2%，ee值由(R)-93.3±0.1%提升至(R)-96.6±0.0%；对反应进程的考察中发现，前60min产率为48.0%；通过对P450PL2-SG的底物谱考察中发现，催化1a-1d、1g、1h和1j时产率大于70%，催化1a-1c和1e-1k时ee值大于(R)-90%，其中催化1d、1f和1g时ee值大于(R)-98.8%。 结论：通过P450酶的分子改造与高通量筛选方法相结合，筛选获得活性和立体选择性改良的突变体P450PL2-SM3和P450PL2-DM3；将活性较高的突变体P450PL2-SM3与GDH共表达，构建辅酶循环系统，获得重组突变菌P450PL2-SG，实现10mM苯乙烯的不对称环氧化反应，其产率为75.7±2.4%，ee值为(R)-96.6±0.0%；对其底物普适性的考察中发现，P450PL2-SG具有良好的底物适配性，可催化10余种苯乙烯类底物的不对称环氧化，并表现出良好的产率与极高的光学纯度，进而为建立P450单加氧酶催化烯烃不对称环氧化反应的高效与高选择性的生物催化合成路线又迈进了一步。
P450单加氧酶;不对称环氧化;分子改造;高通量筛选;烯烃
遵义医科大学
硕士
制药工程学
袁伟成
2020
中文
TQ460.1
2023-07-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）