SOD1G93A通过ROS升高影响VSC4.1细胞线粒体功能和诱导细胞凋亡的机制研究
目的：构建过表达SOD1G93A的VSC4.1运动神经元细胞模型，在该模型中探讨SOD1G93A是否通过改变线粒体内ROS水平来影响线粒体功能和诱导细胞凋亡及其具体机制。 方法：通过分子克隆技术构建mito-SOD1-EGFP和mito-SOD1G93A-EGFP质粒，并转染VSC4.1细胞系建立细胞模型，其中未转染的VSC4.1细胞为空白组，转染mito-SOD1-EGFP的细胞为正常对照组，转染mito-SOD1G93A-EGFP的细胞为ALS运动神经元细胞模型组。用MitoSoxRed标记线粒体内ROS，用TMRE指示线粒体膜电位，在激光共聚焦显微镜下检测不同组细胞的线粒体功能。利用ATP检测试剂盒检测细胞内ATP的水平，用Hoechst33258标记细胞核在荧光显微镜下观察细胞核形态的变化。在转染mito-SOD1G93A的细胞中分别加入N-乙酰半胱氨酸（NAC）和JNK蛋白阻断剂SP600125作用后，运用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率，用WesternBlot技术检测各组细胞中ASK1、p-ASK1、JNK、p-JNK蛋白的表达水平，以及检测线粒体途径凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、capase-3的表达水平。在激光共聚焦显微镜下检测分别加入NAC和SP600125作用后SOD1G93A组线粒体ROS水平和膜电位的改变，并检测细胞内ATP的水平。 结果：mito-SOD1-EGFP和mito-SOD1G93A-EGFP质粒经PCR鉴定和测序，结果表明mito-SOD1G93A质粒的第93号密码子由GGT变为GCT，重组质粒构建成功。将mito-SOD1-EGFP和mito-SOD1G93A-EGFP质粒转染至VSC4.1细胞48h后，检测转染效率在50％以上的细胞可用于后续实验研究。线粒体ROS检测结果表明与正常对照组相比，转染mito-SOD1G93A组细胞的线粒体ROS水平显著升高（P＜0.05）。线粒体膜电位检测结果显示，与正常对照组相比转染mito-SOD1G93A组细胞的线粒体膜电位明显降低（P＜0.05）。转染mito-SOD1G93A组细胞内ATP水平明显减少（P＜0.05）。用Hoechst33258标记细胞核，观察结果显示空白组和正常对照组的细胞核形态规则，呈弥散均匀的淡蓝色荧光，而转染mito-SOD1G93A组细胞核染色质固缩，核内出现浓染致密的颗粒状或点状亮蓝色荧光。在转染mito-SOD1G93A的细胞中分别加入NAC（1000μmol/L）和SP600125（10μmol/L）作用6h后，用流式细胞术检测各组细胞凋亡，结果显示转染mito-SOD1G93A组的细胞凋亡率为54.74±3.28%，与正常对照组相比明显升高。加入NAC组凋亡率为21.73±3.50%，加入SP600125组凋亡率为31.74±3.90%，与转染mito-SOD1G93A组相比均降低（P＜0.05）。提取各组细胞总蛋白，WesternBlot检测结果显示，与正常对照组相比，转染mito-SOD1G93A组的ASK1和JNK磷酸化水平明显升高，凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平降低，Bax和capase-3的表达水平升高。与转染SOD1G93A组相比，加入NAC组的ASK1和JNK磷酸化水平降低，Bcl-2表达水平升高，Bax和capase-3的表达水平降低；加入SP600125组的ASK1、p-ASK1和JNK表达水平无明显变化，JNK的磷酸化水平降低，Bcl-2表达水平升高，Bax和capase-3的表达水平降低。与转染mito-SOD1G93A组相比，加入NAC组和加入SP600125组的细胞线粒体内ROS水平均明显降低，线粒体膜电位升高，细胞内ATP水平升高（P＜0.05）。 结论： （1）突变的SOD1G93A会引起VSC4.1细胞线粒体中产生过量的ROS，导致线粒体膜电位丢失，生成ATP减少，损伤线粒体功能。 （2）SOD1G93A细胞模型中异常增多的ROS作为早期信号分子，通过激活ASK1-JNK信号通路，介导线粒体途径的细胞凋亡。 （3）NAC可降低过表达SOD1G93A的细胞线粒体ROS水平，能抑制ROS激活的ASK1-JNK信号通路介导的细胞凋亡。通过阻断JNK蛋白，能抑制SOD1G93A引起ROS升高而诱导的细胞凋亡。NAC和SP600125均能改善线粒体功能。
运动神经元细胞模型;线粒体;细胞凋亡;信号通路
遵义医科大学
硕士
转化医学
罗果
2020
中文
R329.28
2023-07-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）