调节钙稳态对转染SOD1G93A的VSC4.1细胞线粒体功能的影响
目的：探讨转染SOD1G93A的VSC4.1细胞模型中钙信号稳态调节机制，通过调节细胞内重要钙通道蛋白恢复细胞内钙稳态，研究钙稳态对线粒体功能的影响。 方法：体外培养运动神经元细胞系VSC4.1；通过分子克隆技术构建mito-SOD1-EGFP和mito-SOD1G93A-EGFP质粒，转染VSC4.1细胞系构建细胞模型并进行鉴定。未转染的VSC4.1细胞为空白组(blank)，转染mito-SOD1的VSC4.1细胞为正常对照组，转染mito-SOD1G93A的VSC4.1细胞为ALS细胞模型组。在不同细胞模型组中分别加入Ca2+特异性荧光探针Rhod-2AM，在共聚焦显微镜下检测胞浆内Ca2+浓度。Westernblot技术检测细胞内关键钙通道蛋白NCX、MCU、IP3R和RyR的表达水平。在不同细胞模型组中分别加入线粒体膜电位指示剂TMRE和线粒体内活性氧指示剂MitoSoxRed，共聚焦显微镜下检测线粒体膜电位与线粒体内活性氧的水平。在不同细胞组加入ATP检测试剂分别检测线粒体生成ATP的能力。在转染mito-SOD1G93A细胞组中分别加入MCU阻滞剂Ru360、NCX阻滞剂KB-R7943、IP3R激动剂ATP-Na2和L型钙通道激动剂FPL4176，在共聚焦显微镜下检测钙稳态的恢复情况，以及检测线粒体膜电位、线粒体内活性氧水平的变化情况。用Hoechst33258标记不同细胞模型组的细胞核，在倒置荧光显微镜下观察细胞核形态的改变。 结果：在pEGFP-N1质粒的NheⅠ和XhoⅠ酶切位点间插入线粒体定位序列mito，在HindⅢ与BamHⅠ酶切位点间分别插入SOD1和SOD1G93A序列，构建的重组质粒，测序比对结果显示mito-SOD1G93A-EGFP质粒第93位密码子由GGT变为GCT表明质粒构建成功。将质粒转染VSC4.1细胞，转染24h后在荧光显微镜下观察GFP的表达情况，转染效率超过50％的细胞用于后续实验。用Rhod-2AM标记各组细胞内Ca2+，经共聚焦显微镜检测结果显示mito-SOD1G93A组与mito-SOD1组相比细胞内Ca2+浓度降低，具有统计学差异。用Westernblot技术检测细胞内关键钙通道蛋白，结果显示与mito-SOD1组相比，mito-SOD1G93A组细胞的MCU表达量降低，NCX表达量降低，IP3R表达量降低，RyR无明显变化。对各组细胞模型的线粒体膜电位和线粒体活性氧水平进行检测，共聚焦显微镜检测结果显示与mito-SOD1组相比，转染mito-SOD1G93A的ALS细胞模型组线粒体膜电位降低，线粒体内活性氧浓度升高。ATP检测实验结果显示与mito-SOD1组相比，mito-SOD1G93A组细胞线粒体内ATP浓度降低。在转染mito-SOD1G93A的ALS细胞模型组中分别加入Ru360、KB-R7943、ATP-Na2和FPL64176，分别作用30min、10min、10min和30min后，检测细胞内Ca2+浓度变化、线粒体膜电位和线粒体活性氧水平，结果显示与未加阻滞剂或激动剂的mito-SOD1G93A组相比细胞内的Ca2+浓度升高、线粒体膜电位升高、线粒体活性氧浓度降低，具有统计学差异。用Hoechst33258标记不同细胞模型组的细胞核，结果显示与mito-SOD1组相比，mito-SOD1G93A组细胞的细胞核致密浓染，呈高亮的细胞明显增多。在mito-SOD1G93A组中分别加入Ru360、KB-R7943、ATP-Na2和FPL64176，分别作用30min、10min、10min和30min后，细胞核呈高亮的细胞明显减少。 结论： （1）SOD1G93A通过影响3个钙通道关键蛋白MCU（下调）、NCX（下调）和IP3R（上调）的表达量和功能，降低运动神经元细胞中的Ca2+浓度，引起细胞钙稳态异常。 （2）通过调节细胞内4个钙通道关键蛋白MCU（下调）、NCX（下调）、IP3R（上调）和L型钙通道（上调）的功能，能够使转染SOD1G93A组细胞内Ca2+浓度升高，恢复细胞内钙稳态。 （3）通过调节MCU、NCX、IP3R和L型钙通道的功能，能够使转染SOD1G93A组细胞内线粒体膜电位上升，降低线粒体内活性氧水平，恢复线粒体功能，减少细胞核呈凋亡早期状态的细胞数量。
肌萎缩侧索硬化症;运动神经元;钙通道;线粒体;SOD1G93A;VSC4.1细胞
遵义医科大学
硕士
转化医学
罗果
2020
中文
R746.4
2023-07-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）