七氟烷吸入麻醉对大鼠海马胆碱能系统影响的相关研究
第一部分七氟烷吸入麻醉对新生期大鼠海马α7nAChR、ChAT、AChE的影响 目的:探究七氟烷吸入麻醉对新生大鼠海马α7nAChR、ChAT、AChE的影响. 方法:72只健康新生SD大鼠随机分为四组:对照组(Con组,n=18)、七氟烷吸入组(Sev组,n=18)、α7nAChR激动剂+七氟烷吸入组(PNU组,n=18)和α7nAChR拮抗剂+七氟烷吸入组(MLA组,n=18).Con组大鼠吸入1L/minAir+1L/minO22h,Sev组大鼠同时间点吸入3.4％七氟烷+运载气体2h,PNU组大鼠在单次腹腔注射α7nAChR激动剂PNU-2829875mg/kg24h后吸入3.4%七氟烷+运载气体2h,MLA组单次腹腔注射α7nAChR拮抗剂MLA3mg/kg24h后吸入3.4%七氟烷+运载气体2h.四组大鼠按照取材时间随机分为三个亚组即吸入结束后2h组(麻醉恢复期)、1周组(新生晚期)、4周组(幼年期),每组大鼠取6只于进行海马组织取材,采用实时荧光定量PCR法检测大鼠各期右海马α7nAChR、ChAT、AChE的mRNA相对表达量,同时WesternBlot法检测大鼠各期左海马相应蛋白相对表达量. 结果:1、RT-PCR检测mRNA组内比较:Con组α7nAChR、ChAT及AChEmRNA的表达在4周明显高于1周及2h(P＜0.05);Sev组α7nAChRmRNA的表达在4周时明显高于1周及2h(P＜0.05),ChAT及AChEmRNA的表达在1周及4周明显低于2h(P＜0.05);PNU组α7nAChR、ChaTmRNA的表达在4周明显高于1周及2h(P＜0.05),AChEmRNA的表达在4周明显高于1周(P＜0.05);MLA组α7nAChRmRNA的表达在4周明显高于2h(P＜0.05),ChaTmRNA表达在4周明显高于2h及1周(P＜0.05),1周明显高于2h(P＜0.05),AChEmRNA表达在1周明显高于2h(P＜0.05). 2、RT-PCR检测mRNA表达组间比较:①α7nAChRmRNA的表达在吸入结束后2h:PNU、MLA组较Sev组明显升高(P＜0.05);1W:MLA组明显高于其他三组,Sev组显著低于Con(P＜0.05);4周:PNU组较Sev组明显升高(P＜0.05),其余各组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).②ChaTmRNA的表达在吸入结束后2h:Sev组较Con组明显升高,PNU组较Sev组明显降低,而MLA组较其余三组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);1W:MLA组较Con、PNU组明显升高(P＜0.05);4W:MLA组较其余三组明显升高,PNU组较Sev、Con组明显升高(P＜0.05),其余组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).③AChEmRNA的表达在吸入结束胡2h:Sev组较Con组明显升高,MLA、PNU组较Sev组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);吸入结束后1W:MLA组较其余三组明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05);吸入结束后4周:Sev组较Con组明显降低,MLA、PNU组较Sev组明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05),其余各组在各时间点比较差异无统计学意义(P＞0.05). 3、WesternBlot检测蛋白表达组内比较:α7nAChR蛋白表达在1W及4W明显低于2h,ChaT及AchE在1W及4W均明显高于2h,ChaT在4W明显高于1W,差异均有统计学意义(P＜0.05);Sev组α7nAChR、ChaT及AchE蛋白相对表达量表达在1W及4W均明显高于2h,ChaT在4W明显高于1W,AchE在4W明显低于1W,差异均有统计学意义(P＜0.05);PNU组α7nAChR、ChaT及AchE在1W均明显高于2h及4W,ChaT及AchE在4W均明显高于2h,α7nAChR在4W明显低于2h,差异均有统计学意义(P＜0.05);MLA组ChaT及AchE蛋白表达在1W及4W均明显高于2h,ChaT在4W明显高于1W,差异均有统计学意义(P＜0.05). 4、WesternBlot检测蛋白表达组间比较:①α7nAChR蛋白表达吸入结束后2h:Sev、PNU、MLA组较Con明显降低,PUN组较Sev组明显升高,MLA组较PNU、Sev组明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05);1周:Sev组较Con组明显升高,PNU组较Con、Sev组明显升高,MLA组较其余三组明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05);4周:Sev组显著高于Con组,MLA组和PNU组显著低于Con组和Sev组,差异均有统计学意义(P＜0.05),其余时间点各组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).②ChAT蛋白表达在吸入结束后2h:Sev、MLA、PNU组较Con组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);1周:Sev组显著低于Con组,而PNU、MLA组较Sev组明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05);4周:MLA组较其余三组明显升高,Sev、PNU组较Con组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05),其余各时间点各组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).③AChE蛋白表达在吸入结束后2h:PNU和MLA组显著低于Con及Sev组,差异有统计学意义(P＜0.05);1周:PNU组显著高于Con和Sev组,MLA组较PNU组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);4周:Sev组显著低于Con组,PNU组显著高于Sev组,差异有统计学意义(P＜0.05),其余各时间点各组间比较差异无统计学意义(P＞0.05). 结论:1、七氟烷吸入麻醉抑制新生期大鼠麻醉恢复期、促进新生晚期及幼年期α7nAChR的表达,α7nAChR激动剂能逆转七氟烷对α7nAChR的抑制作用,拮抗剂能增加七氟烷对α7nAChR的抑制作用; 2、七氟烷吸入麻醉对新生期大鼠吸入麻醉后各个时期AChE、ChAT基因及蛋白表达均有抑制作用,而α7nAChR激动剂和拮抗剂均可不同程度逆转七氟烷抑制对AChE、ChAT的抑制作用. 第二部分七氟烷吸入麻醉对大鼠海马CA1区细胞外液Ach含量的影响 目的:通过在体微透析技术结合液相色谱/质谱联用法检测大鼠七氟烷吸入麻醉后海马CA1区细胞外液Ach的含量,探讨七氟烷对中枢胆碱能递质的影响. 方法:12只健康SD大鼠(体重250-350g),随机分为对照组(Con组,n=3)、七氟烷吸入组(Sev组,n=3)、α7nAChR激动剂+七氟烷吸入组(PNU组,n=3)和α7nAChR拮抗剂+七氟烷吸入组(MLA组,n=3).Sev组大鼠在海马CA1区植入微透析导管后24h吸入2.6%七氟烷+1L/minAir+1L/minO2,在吸入结束后2h、1d及3d分别对海马CA1区进行透析收集透析液并-80℃保存;Con组在海马CA1区植入微透析导管后24h吸入1L/minAir+1L/minO2,之后处理同Sev组;PNU组和MLA组在海马CA1区植入微透析导管并分别单次腹腔注射α7nAChR激动剂PNU-2829875mg/kg和拮抗剂MLA3mg/kg24h后处理同Sev组.待微透析样本收集结束后,用液相色谱/质谱联用法(LC/MS)分别进行方法专属性、精密度考察并对标准品及样品进行检测,最后根据标准曲线计算不同时间点Ach含量的平均值并比较. 结果:各组大鼠植入导管、吸入气体及透析过程中状态良好,脑组织冰冻切片镜下观察结果显示微透析导管均在海马CA1区.LC/MS法测Ach方法专属性好,标准曲线回归方程为:y=79.263x-11.746(R2=0.9987),在1.72-110.00nM范围内线性关系良好,Ach最低检测限位0.43nM,日间精密度RSD＜10%,日内精密度＜15%,上述结果符合生物样本分析法原则.吸入后各组大鼠海马CA1区细胞外液Ach的含量:Con组在2h、1d、3d分别为:19.64±3.69nM、17.60±2.35nM、14.18±1.60nM,而Sev分别为4.08±0.82nM、4.80±0.94nM、3.90±0.70nM,在各个时间点海马CA1区Con组及Sev组细胞外液Ach含量组内比较无明显差异(P＞0.05),PNU组在吸入麻醉后2h、1d、3d海马CA1区Ach含量分别为19.92±3.57nM、23.99±3.51nM、21.9±1.90nM,组内比较1d明显高于2h,差异有统计学意义(P＜0.05);MLA组在吸入麻醉结束后2h、1d、3d海马CA1区Ach含量分别为10.75±2.18nM、14.29±1.88nM、14.29±1.88nM,组内比较1d及3d明显高于2h,差异有统计学意义(P＜0.05).吸入结束后各组大鼠海马CA1区细胞外液Ach的变化组间比较:在吸入结束后2h:Sev组海马CA1区细胞外Ach含量较Con组明显降低,PNU及MLA组较Sev组明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05),而MLA组较Con及PNU组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);吸入麻醉后1d及3d:Sev组较Con组明显降低,PNU组较Con和Sev明显升高,MLA组较Sev组明显升高,较PNU组降低,其余时间点各组间比较差异不明显(P＞0.05). 结论:1、七氟烷吸入麻醉能明显减少大鼠海马CA1区Ach的含量,我们推测这一变化与麻醉后近期发生认知损害相关,其机制是抑制Ach的合成和(或)分解加速尚需进一步研究; 2、α7nAChR激动剂PNU-282987能逆转七氟烷吸入麻醉对大鼠海马CA1区Ach的影响,而拮抗剂MLA可部分逆转七氟烷吸入麻醉对大鼠海马CA1区Ach的影响.由此推测,该受体激动剂或拮抗剂有望成为预防或治疗七氟烷麻醉后近期认知损害的选择之一.
吸入麻醉;七氟烷;海马;拮抗剂;在体微透析
遵义医科大学
硕士
麻醉学
朱昭琼
2019
中文
R614
2023-07-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）