SARS-CoV-2刺突蛋白基因重组新城疫病毒的构建与免疫原性研究
新型冠状病毒肺炎（CoronaVirusDisease2019,COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SevereAcuteRespiratorySyndromeCoronavirus2,SARS-CoV-2）感染引起的一种传播能力极强的人兽共患传染病。虽尚未确定SARS-CoV-2的中间宿主，但SARS-CoV-2可引起广泛的动物感染，包括宠物、家畜以及动物园和水族馆中部分的动物。因此，为了有效控制SARS-CoV-2在易感宿主中的传播，迫切需要研制安全、有效的动物用新冠肺炎疫苗。 SARS-CoV-2的刺突蛋白（Spikeprotein,S）是一种锚定在病毒粒子表面的高度糖基化的I型膜蛋白。S蛋白决定着病毒的宿主范围和致病力。S蛋白是宿主抗病毒感染过程中诱导保护性免疫反应的主要抗原，也是治疗和疫苗设计的主要靶点。预融合稳定的S蛋白的免疫原性是优于野生型的免疫原，其S蛋白的表达水平更高。因此，构建预融合稳定的S蛋白将利于新冠肺炎疫苗的研发。 新城疫病毒（NewcastleDiseaseVirus,NDV）是副粘病毒科的一种负链RNA病毒。与其它病毒载体相比，弱毒疫苗株LaSota作为疫苗载体具有很多优点：首先新城疫病毒可通过鼻腔接种，同时诱导粘膜、体液和细胞免疫反应。其次，LaSota的安全性和有效性已在多种动物中得到验证。新城疫病毒载体疫苗还具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本低廉，易于规模化生产以满足大规模的需求。 本研究在SARS-CoV-2S蛋白基因密码子优化的基础上，将S蛋白Furin裂解位点氨基酸由“RRAR”突变为“GSAS”。进一步用组织型纤溶酶原激活因子信号肽（Tissueplasminogenactivator,tPA）基因序列替换原有的S蛋白信号肽序列。同时，将六个位点氨基酸残基均突变为脯氨酸（F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P），人工合成SARS-CoV-2S蛋白突变体基因（tPASopti6P）。本研究利用实验室建立的重组NDV反向遗传学系统，构建并拯救获得表达SARS-CoV-2tPASopti6P蛋白的重组新城疫病毒rLa-tPASopti6P。通过致病性指标测定，rLa-tPASopti6P为温和型毒株并保持了与亲本疫苗株rLaSota相同的高滴度生长特性。间接免疫荧光和免疫印迹试验证实了tPASopti6P蛋白在重组病毒rLa-tPASopti6P感染的BHK细胞膜表面正确表达。在小鼠的安全性评价实验中，重组毒株与亲本株一样具有良好的安全性。以BALB/c小鼠为动物模型对rLa-tPASopti6P的免疫原性和攻毒保护效力进行评估，rLa-tPASopti6P肌注免疫后诱导小鼠产生了较高水平的SARS-CoV-2特异性抗体，能显著降低小鼠上、下呼吸道SARS-CoV-2病毒RNA和感染性病毒载量，快速清除小鼠上、下呼吸道的SARS-CoV-2，为免疫小鼠提供有效的攻毒保护。本研究结果表明，重组病毒rLa-tPASopti6P具有良好的安全性、免疫原性和攻毒保护效力，具有成为动物用新型冠状病毒肺炎疫苗的潜力。
新型冠状病毒肺炎;严重急性呼吸综合征;冠状病毒2型;刺突蛋白;基因重组;新城疫病毒
中国农业科学院
硕士
兽医
葛金英
2022
中文
S856.3
2023-07-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）