增强型猫ω干扰素的制备及生物学活性分析
猫ω干扰素（FeIFN-ω）属于I型IFN，主要由白细胞产生，具有广谱抗病毒、抗细胞增殖活性。重组猫ω干扰素（rFeIFN-ω）是第一个被批准用于治疗猫病毒性疾病和肿瘤性疾病的干扰素制剂。rFeIFN-ω在治疗某些病毒感染疾病方面的疗效优于IFN-α，具有良好的应用前景。目前，我国宠物猫饲养量激增，有效疫苗和治疗药品缺乏，尤其是商品用猫ω干扰素严重缺乏，因此加速猫用生物制剂的研发进程势在必行。 为了研制具有高活性的rFeIFN-ω，本研究首先通过原核表达系统制备rFeIFN-ω，利用PCR扩增FeIFN-ω成熟蛋白区，构建重组质粒pET-SUMO-FeIFN-ω，在大肠杆菌BL21（DE）感受态细胞中可溶性表达了重组蛋白rFeIFN-ω，SDS-PAGE结果显示rFeIFN-ω在20℃诱导条件下蛋白表达量较高且杂蛋白相对较少；亲和层析纯化蛋白，产量达到50mg/100mL。在猫肾细胞（CRFK）上对原核表达rFeIFN-ω进行抗病毒活性分析，结果显示rFeIFN-ω对猫杯状病毒（FCV）有一定的抑制作用。然后利用293悬浮细胞（293s）结合慢病毒包装方法对rFeIFN-ω进行真核表达。将FeIFN-ω全基因克隆至慢病毒载体，构建重组质粒pLVX-FeIFN-ω，在293T细胞中包装慢病毒，收获的病毒上清转导293s细胞大量表达目的蛋白，收集细胞上清进行亲和层析，结果显示rFeIFN-ω蛋白产量为19mg/100mL。为了比较原核和真核表达rFeIFN-ω的生物学活性，在CRFK细胞上检测rFeIFN-ω抑制FCV复制的能力和双荧光素酶试验分析rFeIFN-ω对干扰素刺激反应元件（ISRE）的激活能力。结果显示真核表达rFeIFN-ω抗病毒活性及ISRE启动子激活能力均高于原核表达。在此基础上，通过分子对接技术对FeIFN-ω氨基酸序列进行突变改造，获得3条突变后的基因序列FeIFN-ω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R。在293T细胞中包装慢病毒后转导293s细胞，表达重组蛋白rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R，纯化后蛋白产量分别为：35mg/100mL、24mg/100mL、22mg/100mL。随后比较野生型及突变型rFeIFN-ω体外抗FCV、猫疱疹病毒（FHV）和猫冠状病毒（FCoV）复制能力及激活干扰素刺激基因（ISGs）表达能力，结果显示rFeIFN-ω-T188R的体外抗病毒活性和激活ISGs表达活性均最高；进一步研究结果显示，rFeIFN-ω-T188R与干扰素受体（IFNAR1/2）结合亲和力强于野生型rFeIFN-ω。最后比较rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-T188R和商品化重组猫ω干扰素体外抗FCV活性，结果显示rFeIFN-ω-T188R的抗病毒活性强于商品化重组猫ω干扰素。 综上，本研究获得可溶性原核表达和真核表达的rFeIFN-ω蛋白，且真核表达产物生物学活性优于原核。FeIFN-ω的188位氨基酸是影响其生物学活性的关键氨基酸位点，将其突变为精氨酸后蛋白活性明显提高，体外试验表明增强型的rFeIFN-ω-T188R较高的抗病毒活性，为研发新型、高效的抗病毒干扰素药物提供了依据。
猫ω干扰素;可溶性原核表达;rFeIFN-ω-T188R;氨基酸位点;生物学活性
中国农业科学院
硕士
兽医
曲连东
2022
中文
S859.7
2023-07-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）