会员HOT
首页 应用会员HOT
万方学位
×

点击收藏，不怕下次找不到~

@万方数据
个人中心
退出

学位专题

目录>
  • 封面
    声明
    中文摘要
    英文摘要
    目录
    主要符号对照表
    第一章 绪论
    1.1 牛呼吸道疾病综合征
    1.2 牛病毒性腹泻病毒概述
    1.3 牛传染性鼻气管炎病毒概述
    1.4 牛副流感病毒3型概述
    1.5 牛呼吸道合胞体病毒概述
    1.6 D型流感病毒概述
    1.7 荧光定量PCR检测方法
    1.8 内参的研究进展
    1.9 研究的目的与意义
    第二章 牛呼吸道疾病综合症病毒性病原荧光定量PCR检测方法的建立
    2.1 试验材料
    2.1.1 细胞和病毒
    2.1.2 主要试剂和耗材
    2.2 试验方法
    2.2.1 细胞和病毒培养
    2.2.2 引物和探针设计
    2.2.3 阳性标准品的制备
    2.2.4 特异性试验
    2.2.5 反应条件的优化
    2.2.6 敏感性试验和标准曲线的建立
    2.2.7 多重荧光定量PCR敏感性试验和标准曲线的建立
    2.2.8 重复性试验
    2.2.9 临床样品检测
    2.3 试验结果与分析
    2.3.1 质粒标准品的构建
    2.3.2 引物特异性检测
    2.3.3 单重荧光定量PCR敏感性试验和标准曲线的建立
    2.3.4 多重荧光定量PCR检测方法的建立
    2.3.5 多重荧光定量PCR敏感性和标准曲线的建立
    2.3.6 多重荧光定量PCR重复性试验
    2.3.7 临床样品检测
    2.4 讨论
    第三章 牛病毒性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立
    3.1 试验材料
    3.2 试验方法
    3.2.1 引物和探针设计
    3.2.2 阳性标准品制备
    3.2.3 特异性试验
    3.2.4 反应条件优化
    3.2.5 敏感性试验和标准曲线的建立
    3.2.6 细胞培养病毒敏感性试验
    3.2.7 重复性试验
    3.2.8 临床样品检测
    3.3 试验结果与分析
    3.3.1 引物特异性检测
    3.3.2 假病毒构建
    3.3.3 双重荧光定量PCR检测方法的建立
    3.3.4 敏感性试验和标准曲线的建立
    3.3.5 细胞培养病毒敏感性试验
    3.3.6 双重荧光定量PCR重复性试验
    3.3.7 实验室样品检测
    3.4 讨论
    第四章 牛病毒性腹泻病毒荧光定量PCR分型检测方法的建立
    4.1 试验材料
    4.2 试验方法
    4.2.1 细胞和病毒培养
    4.2.2 引物和探针设计
    4.2.3 阳性标准品制备
    4.2.4 特异性试验
    4.2.5 敏感性试验和标准曲线的建立
    4.2.6 反应条件优化
    4.2.6 多重荧光定量PCR敏感性试验和标准曲线建立
    4.2.7 重复性试验
    4.3 试验结果与分析
    4.3.1 质粒标准品的构建
    4.3.2 引物特异性检测
    4.3.3 敏感性试验和标准曲线的建立
    4.3.4 多重荧光定量PCR检测方法的建立
    4.3.5 多重荧光定量PCR重复性试验
    4.3.6 临床样品检测
    4.4 讨论
    第五章 结论
    参考文献
    致谢
    作者简历
<

牛呼吸系统疾病重要病毒性病原荧光定量PCR方法的建立

张娟
中国农业科学院
下载全文
在线阅读
引用
牛呼吸道疾病综合征存在于世界范围的养牛场，给养殖业造成了重大经济损失，引起BRDC的主要病毒性病原包括牛病毒性腹泻病毒、牛疱疹病毒1型、牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞病毒以及近几年新发的D型流感病毒。在患有牛呼吸道疾病综合征的病例中，常存在多种病原的混合感染。　　本研究建立了一步式多重实时荧光定量PCR检测方法，可同时检测BVDV、BoHV-1、BPIV3、BRSV和IDV五种病原。在BVDV的5’-UTR、BoHV-1的gE、BPIV3的M、BRSV的N和IDV的PB1基因保守区域设计引物和探针，建立单重荧光定量PCR检测方法，通过条件优化组合成多重荧光定量PCR方法。通过特异性试验检测与牛其他致病菌或病毒以及细胞基因组无非特异性扩增，证明具有良好的特异性。单重实时荧光定量PCR检测限约为10拷贝/反应，五重实时RT-PCR检测限约为100拷贝/反应，BVDV、BoHV-1的循环阈值（CT值）为36，BPIV3、IDV约为37，BRSV约为39。利用建立的五重荧光定量PCR对中国东北地区213份表现呼吸道疾病的牛鼻拭子进行检测，结果显示BVDV阳性63份（29.577%）、BoHV-1阳性55份（25.822%）、BPIV3阳性32份（15.023%）、BRSV阳性6份（2.817%）和IDV阳性15份（7.042%），这些阳性样品中有52份同时存在两种或两种以上病原，表明采样地区BRDC主要病原为BVDV、BoHV-1和BPIV3，同时存在严重的混合感染。　　从多重实时荧光定量PCR检测结果来看，BVDV是牛呼吸道疾病综合征中感染率最高的病毒性病原，由于多重实时荧光定量PCR检测敏感性有一定程度的降低，本研究针对BVDV的检测建立了一种pan-BVDV双重荧光定量RT-PCR检测方法。参照24个BVDV-1分离株、37个BVDV-2分离株和21个Hobi-like分离株的5’-UTR区域的保守序列设计引物和探针，能够快速高效的检测BVDV的感染。其次使用含有ZsGreen1基因的慢病毒载体plvx-IRES-ZsGreen1包装慢病毒，设计一个检测ZsGreen1基因的特定的引物-探针ROX系统，作为通用异源内部对照，用于监测RNA提取过程因RNA降解导致假阴性结果。设置体外转录RNA作为反转录以及荧光定量PCR反应对照，加入101~107拷贝数的ZsGreen1，结果证明对BVDV的扩增无影响。该pan-BVDV双重荧光定量RT-PCR检测灵敏度约为10拷贝/反应，对细胞培养病毒进行提核酸后进行荧光定量PCR检测，检测灵敏性约为10TCID50/反应；可特异性检测BVDVI型、Ⅱ型和Hobi-like三个基因型，对同瘟病毒属的CSFV和BDV以及MDBK细胞检测均为阴性，证明具有良好的特异性。对本实验室攻毒试验动物样品进行检测，包括肛拭子以及组织和外周血，同时用OIE荧光定量检测方法核对，在754份样品中共计检测出阳性样品273份，两者检测结果完全一致。　　BVDV在中国分离株主要是BVDV-1，陆续有BVDV-2，Hobi-like毒株在中国分离到，为调查BVDV的不同基因型在中国的流行情况，对BVDV-1、BVDV-2和Hobi-like三种基因型分别设计特异的引物和探针，同时采用含有ZsGreen1基因的慢病毒系统作为异源内部对照，建立了可以同时区分BVDV三个基因型的四重荧光定量PCR检测方法。不同基因型的引物和探针无交叉反应，与其他病原无交叉反应，具有良好的特异性。单次实时荧光定量RT-PCR检测限约为10拷贝/反应，进行条件优化后，多重实时荧光定量RT-PCR检测限为100拷贝/反应。对黑龙江3854份样品进行检测，检测的159份阳性样品皆为BVDV-1。　　综上所述，本研究建立了同时检测BRDC主要病毒性病原BVDV、BoHV-1、BPIV3、BRSV和IDV等五种病原的五重荧光定量PCR检测方法，建立了pan-BVDV双重荧光定量RT-PCR检测方法，同时建立了可区分BVDV-1、BVDV-2和Hobi-like三个基因型的四重荧光定量RT-PCR检测方法。上述检测方法均具有良好的特异性和敏感性。五重荧光定量PCR对现地牛呼吸道疾病可做出快速诊断；pan-BVDV双重荧光定量RT-PCR可用于持续性感染牛的检测，为BVDV的防控乃至根除提供可靠的技术支撑，同时为生物制品用的胎牛血清、细胞和疫苗BVDV检测提供技术支持；区分BVDV三个基因型的四重荧光定量PCR为了解我国BVDV各基因型的流行情况提供有效的检测手段。本研究为BRDC的防控及养牛业的健康发展提供了一定的技术保障。

牛呼吸道疾病综合征;牛病毒性腹泻病毒;实时荧光定量PCR检测;细胞基因组;非特异性扩增

中国农业科学院

硕士

兽医

朱远茂

2022

中文

S858.23

2023-07-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

相关文献
评论
相关作者
相关机构
打开万方数据APP，体验更流畅