大白菜小孢子遗传转化体系研究
大白菜（BrassicarapaL.ssp.pekinesis）属十字花科芸薹属重要蔬菜作物。转基因技术是研究作物基因功能和培育新品种的重要途径。现有大白菜遗传转化体系存在外植体再生困难、传统农杆菌遗传转化效率极低的问题，构建一种高效、稳定且适宜大白菜的新型遗传转化体系具有重要意义。 本研究以大白菜DH系为试验材料，探索了磁性纳米粒子法对大白菜小孢子及花粉的遗传转化和小孢子为外植体构建基因枪法遗传转化体系。利用基因枪法介导大白菜小孢子遗传转化体系，对紫色大白菜花青素调控开展关键基因功能验证及转录-代谢联合分析，结果如下： 1.磁性纳米粒子法对大白菜小孢子及花粉的遗传转化研究：试验验证磁性纳米粒子对DNA负载范围；使用直径100nm磁性纳米粒子进行0.5、0.75、1.0h磁转化时间梯度试验，仅获得零星GUS转化小孢子，该直径磁性纳米粒子可实现百合、辣椒及黄瓜等薄壁花粉的遗传转化。选择适宜直径纳米粒子并提高磁场强度有望成为大白菜小孢子遗传转化新途径。 2.研究筛选获得了适宜基因枪轰击的大白菜DH系材料，以小孢子为外植体可耐受基因枪多次轰击胁迫且继续诱导胚状体，对基因枪不同轰击参数轰击后小孢子活力及胚状体诱导再生能力统计显示，在轰击次数（3、4、5次）×轰击压力（900、1100、1350psi）×轰击距离（3、6、9cm）组合下，经基因枪轰击后培养72h，处理组小孢子平均活力范围在74.76-88.55％间，对照组小孢子活力为88.09%，与对照相比，小孢子活力无显著性差异；基因枪对小孢子出胚量无显著性影响，在轰击次数为4时，处理组出胚数在16-236个/皿，对照为117个/皿，在细胞培养范畴，大白菜小孢子诱导胚状体发生数量与基因枪轰击参数无必然联系。 3.建立了基因枪法介导大白菜小孢子遗传转化体系及最佳参数：在基因枪轰击参数为4次-1350psi-3cm、4次-1100psi-3cm、4次-900psi-3cm时，小孢子都具有高的瞬时表达效率，平均每皿（3.5mL）转化小孢子数分别为21.67、11.67、11.67个；在轰击次数为4次，轰击压力为900psi，轰击距离为6cm时，小孢子获得遗传转化胚最多，其转化效率达10.82%。 4.紫色大白菜花青素代谢调控研究，对筛选获得重要调控基因Dark_Pur基因克隆，分析发现该基因具备三个外显子及两个内含子结构，其结构及序列与紫色芥菜相同，证明其来源于芥菜；以大白菜DH系小孢子为外植体，利用基因枪法对Dark_Pur基因进行遗传转化及功能验证，并获得紫色大白菜幼苗。利用新构建的大白菜小孢子基因枪法介导的遗传转化体系有助于对大白菜相关功能基因开展深入研究。
大白菜;小孢子;转基因;遗传转化体系;磁性纳米粒子法;花青素
中国农业科学院
博士
蔬菜学
孙日飞
2022
中文
S634.1
2023-07-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）