Aspergillus Nidulans FGSC A4几丁质脱乙酰酶定点突变研究
几丁质是一种天然碱性多糖，主要来源于虾蟹壳，昆虫外骨骼等，但是几丁质结晶度较高，难以溶于水和有机溶剂，应用价值较低，几丁质的脱乙酰基产物为壳聚糖，壳聚糖具有良好的生物相容性，因其安全无毒的特点具有较高的商业价值。生物酶法是利用几丁质脱乙酰酶催化几丁质脱乙酰基生产壳聚糖，且生产的壳聚糖品质较高。但生物酶法受限于天然酶的性质特点，往往产量和反应速率较低。随着分子生物学的发展，当前采用理性设计的方法改善酶催化特性成为了热点。本实验合成了构巢曲霉几丁质脱乙酰酶基因并进行了异源表达，通过理性设计确定了突变位点，成功构建了突变体，并比较了突变前后酶活性的变化，对酶的分子机制进行研究，具体研究内容如下： 构建了AnCDA的重组酵母菌pPICZalphaA-AnCDA，并通过蛋白电泳和酶活测定确定了AnCDA成功异源表达，对重组菌酶学性质研究表明，该酶最适温度和pH为50℃和8.0，且在温度4-60℃孵育30min和pH5-9之间2h剩余酶活仍高于60％，Ca2+、Mg2+可提高酶活，而Zn2+、Ba2+、EDTA等显著抑制酶活。 运用多种生物信息学工具对AnCDA基因进行常规分析，根据几丁质脱乙酰酶催化机制，以及酶与底物结合方式，结合AnCDA的三维结构分析和几丁质脱乙酰酶多序列比对分析结果，最终确定了6个突变位点，分别为：L139G,K164E,Y166W,A171W,A195E,H199D。 利用定点突变试剂盒对6个突变位点进行定点突变，构建了几丁质脱乙酰酶AnCDA的突变重组酵母菌pPICZalphaA-AnCDA-mut6，并通过蛋白电泳和酶活测定确定了AnCDA-mut6成功表达，对重组菌酶学性质研究表明，该酶最适温度和pH为50℃和8.0，且在温度4-40℃孵育30min和pH6-9之间2h剩余酶活仍高于60%，对该酶和未突变的重组酶进行对晶体几丁质分析，突变后酶的比活力为突变前的1.95倍。 通过三维结构模拟和分子动力学分析，探索突变酶催化特性改变的分子机制。结果表明：由于164位氨基酸的突变导致了酶内部氢键数量的减少，进而导致酶温度稳定性的降低；突变酶表面电荷的强弱和增减，底物结合能力增强，底物与酶的结合构象发生变化，可能是酶催化晶体几丁质活性提高的原因。 本研究得到了一株具有更高催化晶体几丁质酶活突变重组菌，并研究了其分子机制，为几丁质脱乙酰酶的进一步开发应用奠定了基础。
几丁质脱乙酰酶;定点突变;基因表达;酶学性质;分子机制
江苏海洋大学
硕士
海洋科学
刘姝
2021
中文
TS201.3
2023-07-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）