GH1家族β-葡萄糖苷酶Bgl1356酶学性质、发酵优化及应用初步研究
β-葡萄糖苷酶可以水解非还原性的β-D-葡萄糖苷键，产生β-D-葡萄糖苷和相应配基，在植物功能性物质的提取过程中具有重要作用。然而，天然的β-葡萄糖苷酶存在获取成本较高、酶活力偏低等问题，难以应用于工业生产，因此性质优良的天然β-葡萄糖苷酶亟待被开发。 本研究从实验室建立的土壤宏基因组文库中筛选出长1356bp，编码451个氨基酸的β-葡萄糖苷酶基因bgl1356，利用生物信息学技术进行分析，发现β-葡萄糖苷酶Bgl1356与GH1家族β-葡萄糖苷酶都具有相同的保守序列TENG。对基因bgl1356进行原核表达获得重组β-葡萄糖苷酶Bgl1356，优化其诱导表达的条件并研究重组酶的酶学性质。结果表明诱导的最佳时间：8h；最佳温度：25℃；最佳IPTG浓度：0.8mM。酶学性质方面Bgl1356的最适反应温度为40℃，在30℃-70℃之间相对酶活均大于40%；最适反应pH为5.0，在pH5.0-8.0时相对酶活力均保留50%以上，具有较强的温度和pH适应性。此外，Bgl1356对大多数金属离子、有机溶剂以及盐和葡萄糖溶液具有较好的耐受力。酶促动力学计算得知Bgl1356的Vmax=3.786mM/min，Km=0.2472mM。 采用了单因素法优化重组Bgl1356菌株的5种培养基组分，然后通过响应面法设计得到了最佳发酵培养条件。结果显示，当碳源为16g/L的淀粉，氮源为1∶1的蛋白胨+酵母粉的复合氮源，无机盐为8g/L的磷酸氢二钾，接种量与装液量分别为12%和50mL时，最大酶活为2596.3U/L，比优化前提高了1.56倍。 以壳聚糖作为载体对Bgl1356进行了固定化研究，以期改善其酶学性质。利用单因素法得知载体用量0.6g、吸附温度40℃、吸附时间8h、最佳吸附酶量0.8mL为最佳固定化条件。进行固定化酶学性质探究，发现固定化后的Bgl1356最适反应温度提高了10℃，50℃-70℃的高温情况下热稳定性明显增高；pH5.0-7.0条件下保存6h后相对酶活力高达60%以上，表明酸碱稳定性也得到了优化；低温和室温存储9天后，相对剩余酶活力仍保持在80%以上。 利用β-葡萄糖苷酶Bgl1356将虎杖中的白藜芦醇苷水解，从而提高白藜芦醇的含量。首先进行最佳酶解体系的探索，结果显示，在加酶量为8mL、pH为6.0、酶解时间为4h、酶解温度为45℃时，白藜芦醇的含量最高。在最佳酶解状态下，白藜芦醇苷的水解率达到90%，且酶解后虎杖中白藜芦醇含量相比酶解前提高了62.3%，由此说明Bgl1356在白藜芦醇的酶解工艺中具有较高的可行性。 本研究分别从生物信息学、原核表达及酶学性质、发酵条件优化、固定化和应用潜能等方面对Bgl1356进行了探究，发现Bgl1356在水解白藜芦醇苷进而提取白藜芦醇的工艺中有较高的应用价值。也为GH1家族β-葡萄糖苷酶的性质和结构提供了较为良好的论证材料，同时拓宽了β-葡萄糖苷酶的研究领域以及种类，为新型β-葡萄糖苷酶的进一步开发提供了参考和数据支撑。
β-葡萄糖苷酶;酶学性质;发酵优化;白藜芦醇;固定化
广东药科大学
硕士
基础医学
李荷
2022
中文
Q556.2
2023-03-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）