蜚蠊肠道菌产紫杉醇合成关键酶7-木糖紫杉烷糖基水解酶的初步研究
紫杉醇（Taxol）是一种二萜类抗癌化合物，临床上广泛应用于晚期卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等治疗。紫杉醇来源于濒危物种-红豆杉属植物的树皮，产量极其有限，导致紫杉醇价格高昂。半合成法是目前紫杉醇工业化生产的主要途径，该方法以10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-deacetylbaccatinⅢ，10-DAB）为前体通过10步化学反应生成紫杉醇。7-木糖-10-去乙酰紫杉醇（7-β-xylosyl-10-deacetylpaclitaxel，7-XDT）等7-木糖紫杉烷类化合物是紫杉醇的母核结构类似物，它主要存在于红豆杉的根、茎、叶中，含量至少是紫杉醇的5倍以上，但未得到充分利用。7-木糖紫杉烷糖基水解酶（7-β-xylosyltaxanes glycoside hydrolases，7-β-xyl）是一种β-木糖苷酶，它可以将7-XDT转化为10-去乙酰紫杉醇（10-deacetylpaclitaxel，10-DAT）和10-DAB，10-DAT目前虽无法用于紫杉醇的半合成，但可通过10-去乙酰巴卡亭Ⅲ10β-O-乙酰转移酶（10-deacetylbaccatinⅢ-10-β-O-acetyltransferase，DBAT）直接生物合成紫杉醇，这说明7-β-xyl是紫杉醇合成中的关键酶。目前7-β-xyl来源较少，因此，开展7-β-xyl新资源研究具有现实意义。蜚蠊食性杂，其肠道菌群多样，并可产生木聚糖酶，但目前尚未见从蜚蠊肠道菌中发现7-β-xyl的相关报道。因此，本研究拟对178株蜚蠊肠道菌的产7-β-xyl能力进行研究，在此基础上，以菌株WA11-1-1为研究对象，初步分析7-β-xyl的酶学性质、优化产7-β-xyl酶条件，全基因组测序挖掘7-β-xyl基因并对其进行分子生物学克隆、表达及活性检测。本文主要研究内容和结果如下： 1.蜚蠊肠道产7-β-xyl菌株的筛选 采用刚果红透明圈法和荧光显色法，发现178株蜚蠊肠道菌中有55株菌具有产木聚糖酶的能力。在此基础上，利用薄层色谱法和高效液相色谱法进一步发现8株链霉菌和2株贪铜菌可产生7-β-xyl，其中链霉菌WA11-1-1具有较好的活性，因此本研究选取菌株WA11-1-1作为后续研究对象。 2.菌株WA11-1-1的鉴定及其7-β-xyl催化合成紫杉醇中间体10-DAT效率的测定 菌株WA11-1-1经形态学特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析，鉴定为娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei），将16S rRNA基因序列上传至GenBank，获得登录号OK047707。菌株WA11-1-1发酵液粗提物可将7-XDT转化为10-DAT和10-DAB，高效液相色谱法显示对10-DAT的转化率达23.48±2.30%。来源于菌株WA11-1-1的7-β-xyl粗酶液最适反应温度为35℃，最适反应pH为6，在20℃~30℃、pH接近7时稳定性更佳，Na+、K+、Mg2+对该酶活性有促进作用，其中Na+作用最为显著，而Ca2+、Fe3+、Zn2+具有抑制作用。3.菌株WA11-1-1产7-β-xyl发酵条件的优化 为了进一步提高菌株WA11-1-1将7-XDT转化为10-DAT的效率，对其产7-β-xyl的发酵条件进行了单因素实验和正交试验优化，最终获得发酵条件的最优组合为：木聚糖浓度0.8%，发酵时间4d，发酵温度28℃，装液量250mL，在此条件下10-DAT的转化率可达到40.72±2.71%，相对优化前提高了1.73倍。 4.菌株WA11-1-1全基因组测序及其7-β-xyl基因的克隆表达 菌株WA11-1-1全基因组测序后，经过数据分析发现具有16个β-木糖苷酶基因，结合文献调研和7-β-xyl粗酶液的酶谱分析结果，推测5个基因可编码7-β-xyl（GE65、GE77、GE79、GE84和GE87）。将上述基因分别进行了原核表达和真核表达，通过诱导表达和免疫荧光法验证了5个蛋白在原核表达系统和真核表达系统中均得到正确表达，但由于研究时间的限制，尚未进行重组蛋白和重组酵母菌水解7-XDT的活性测定。 综上所述，本文从178株蜚蠊肠道菌中筛选共获得10株产7-β-xyl菌株，分别为8株链霉菌和2株贪铜菌，其中娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei）WA11-1-1对10-DAT的转化率达23.48±2.30%，7-β-xyl最适反应温度为35℃，最适反应pH为6。在最适发酵条件（木聚糖浓度0.8%，发酵时间4d，发酵温度28℃，装液量250mL）下，10-DAT转化率可达40.72±2.71%，相对优化前提高了1.73倍。对菌株WA11-1-1进行了全基因组测序，挖掘了5个潜在的7-β-xyl基因，并成功对其进行了克隆和表达。
蜚蠊肠道菌;7-木糖紫杉烷糖基水解酶;酶学性质;基因克隆;基因表达
广东药科大学
硕士
基础医学
金小宝
2022
中文
Q969.25
2023-03-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）