基于肠道菌群探究黄芪灵桦散改善2型糖尿病的机制
2型糖尿病（Type2diabetes mellitus，简称T2DM）是一种复杂的以血糖升高、血脂异常为特征的内分泌代谢疾病，包括不同程度的胰岛素抵抗、胰腺细胞功能障碍、低度炎症、肠道菌群失调以及其他在遗传和环境因素交互作用下的内分泌紊乱。目前，大多数患者需要口服药物和注射疗法来控制血糖。口服药物尤其是中药在体内必然要接触肠道菌群，其治疗效果与肠道菌群的作用密切相关。目前，大部分相关研究集中于中药对于肠道菌群的调节作用，而关于在中药治疗中起关键作用的靶肠道菌的报道较少。 中药黄芪、灵芝、桦褐孔菌及苦瓜均报道有调节血糖的作用，在前期研究中课题组已经发现将四者配伍成中药组方黄芪灵桦散（Huang-Qi-Ling-Hua-San，简称HQLHS）使用可以协助二甲双胍等药物改善T2DM患者的症状，但其作用机制尚未明确。本研究使用高脂饮食（High fat diet，简称HFD）和链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）诱导的T2DM小鼠模型，采用荧光定量PCR、16S rDNA测序以及代谢组学等手段，通过中药组方饲喂、粪便移植（Fecal microbiota transplantation，FMT）、活菌饲喂等多轮动物实验，探讨HQLHS改善高血糖高血脂的作用机制，旨在对其在降血糖作用中潜在的靶肠道菌群进行挖掘。论文包括以下三部分的研究内容： 1.HQLHS改善T2DM作用机制初步探究。利用HFD联合STZ诱导的T2DM小鼠模型，以二甲双胍作为阳性对照，探究HQLHS改善T2DM的潜在机制。结果显示，HQLHS降低了空腹血糖及空腹胰岛素的水平、改善了胰岛素抵抗、增加了肝糖原的积累、下调糖异生关键酶（Pepck和G6pc）的表达；调节血脂四项TG、T-CHO、LDL-C和HDL-C的水平；降低血清中AST和ALT的水平；提高机体SOD、CAT、GSH-PX的活性，降低MDA的含量。此外，HQLHS降低了结肠Tnf-α、Il-6、Il-1β和Mcp-1的表达，减轻肠道炎症。盲肠内容物16S rDNA测序结果显示，HQLHS调节了肠道菌群结构，降低了Blautia、Klebsiella、Ruminiclostridium_5、和Family_XIII_AD3011_group等的相对丰度，增加了Turicibacter、Alistipes、Bifidobacterium、Romboustia、Ruminococcaceae_UCG-009和uncultured_bacterium_f_Christensenellaceae等的相对丰度。相关性分析表明HQLHS富集的肠道菌与血糖血脂代谢异常指标呈负相关。初步推断HQLHS通过调节肠道菌群、减轻炎症和缓解氧化应激改善T2DM。 2.HQLHS富集的有益菌在改善T2DM中的作用。该部分使用了FMT方法，将HQLHS干预后的小鼠粪便移植到T2DM小鼠体内，验证了HQLHS是通过调节肠道菌群尤其上调有益菌，起到改善血糖血脂的作用。FMT除改善了血糖血脂相关生理指标外，qPCR结果还显示其下调了肝脏糖异生关键酶Pepck、G6pc的表达以及脂肪生成基因Pparγ2的表达。FMT在上调了肝脏中胆固醇分解限速酶Cyp7a1表达的同时下调了小肠内Cyp7a1的调控因子Fxr和Fgf15的mRNA水平。FMT降低了小肠内葡萄糖转运体Sglt1和Glut2的表达。ELISA测定结果显示，FMT干预后糖尿病小鼠血清中LPS的含量减少，同时，LPS的识别受体Tlr4以及Nf-κb、Il-1β、Il-6、Tnf-α在肝脏和结肠中的表达水平都显著降低。上述结果表明，HQLHS调节后的肠道菌群能够有效改善T2DM。此外，菌群分析表明Bifidobacterium、Turicibacter、Alistipes、Romboutsia和Christensenella等菌都可以稳定地被HQLHS所富集。 3.Christensenella spp.改善T2DM的作用及其潜在机制研究。在该部分的研究中分别给予T2DM小鼠菌株C.minuta DSM22607（CM）和C.timonensis DSM102800（CT），研究结果如下： (1)Christensenella spp.的干预逆转了T2DM相关的生理指标，包括空腹血糖、空腹胰岛素、口服糖耐量、血脂四项和肝糖原。CM和CT提高了血清中GLP-1的水平，并增加回肠中其前体基因Gcg的表达，表明Christensenella spp.促进了GLP-1的产生。此外，Christensenella spp.提高了糖尿病小鼠的抗氧化水平。CM显著性增加了SOD、GSH-PX的活性，CT显著性增加了CAT、SOD、GSH-PX的活性，两组均降低了血清中MDA的含量。 (2)Christensenella spp.的干预改善了肝脏及肠道糖脂代谢及转运相关基因的表达。CM和CT均显著降低了肝脏中葡萄糖异生相关基因G6pc、Pepck以及脂肪生成基因Pparγ2的表达。Christensenella spp.通过调节肝脏中Cyp7a1和小肠中Fxr和Fgf15的表达调节胆汁酸循环。CM抑制了小肠中Glut2和Sglt1的表达，从而抑制肠道中葡萄糖的吸收。 (3)Christensenella spp.的干预改善了肠道稳态相关基因的表达。CM和CT均降低了血清中LPS的含量，逆转了LPS/TLR4途径上相关基因的表达，包括肝脏和肠道中Tlr4、Nf-κb、Tnf-α、Il-6、Il-1β的表达。Christensenella spp.增强了肠道屏障，表现为增加了结肠紧密连接蛋白Zo-1、Claudin-1的表达。Christensenella spp.同时增加了糖尿病小鼠回肠中抗菌肽Reg3γ、Defa的表达，从而调节肠道稳态。 (4)Christensenella spp.的干预调节了肠道菌群的结构。CM显著增加Bifidobactetium、Phascolarctobacterium和Collisella的相对丰度，显著降低了Muribaculum、Ruminiclostridium_5和Lachnospiraceae_FCS020_group的相对丰度。CT显著增加了Bifidobactetium，Phascolarctobacterium、Turicibacter的相对丰度，同时显著降低了Muribaculum的相对丰度。 (5)Christensenella spp.的干预调节了肝脏和肠道的代谢。CM组肝脏的差异代谢物有乙醇、脂肪酸残基、单甘油酯、甘油三酯、胆碱、葡萄糖1磷酸、葡萄糖、甘油磷酰胆碱和犬尿酸。CT组肝脏的差异代谢物有乙醇、脂肪酸残基、单甘油酯、甘油三酯、葡萄糖1磷酸、葡萄糖、牛磺酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、犬尿酸、色氨酸和酪氨酸。CM组肠道差异代谢物为丁酸、胆碱、甘油磷脂酸胆碱、马尿酸、肌醇、肌酸、乙醇、谷氨酸、异亮氨酸、犬尿酸、苯丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸。CT组肠道差异代谢物为乙酸、丁酸、马尿酸、肌酸、乙醇、犬尿酸和苏氨酸。代谢通路分析表明，CM和CT均显著影响了肝脏中淀粉和糖代谢通路以及三羧酸循环，CM显著调节了肠道中半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路，CT显著调节了肠道磷酸肌醇代谢通路。 综上所述，本研究利用HFD和STZ诱导的糖尿病小鼠模型，基于肠道菌群探究HQLHS改善高血糖的作用机制。实验结果表明，中药组方通过富集肠道中有益菌发挥治疗作用。其中，Christensenella分类群作为一种响应HQLHS干预的显著性生物标志物被识别并筛选出来，并通过活菌饲喂验证了Christensenella是黄芪灵桦散作用的靶肠道菌。同时本研究对Christensenella spp.改善血糖血脂的潜在作用机制进行初步探究，体现为促进小肠中GLP-1的分泌、提高机体抗氧化能力、抑制肝脏糖异生、抑制葡萄糖在小肠中的吸收、增强肠道屏障、减轻LPS诱导的炎症反应以及调节肝脏和肠道代谢产物。
2型糖尿病;黄芪灵桦散;肠道微生物;代谢组学;疗效评价
吉林大学
博士
微生物学
相宏宇
2022
中文
R255.4;R285.5
2023-04-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）