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目录
1 引言
1.1 表皮松解性掌跖角化症
1.2 基因治疗
1.3 CRISPR/Cas9
2.1 主要试剂
2.2 主要溶液
2.2.1 组织DNA裂解液
2.2.2 蛋白裂解液
2.2.3 Running缓冲液
2.2.4 Transfer缓冲液
2.2.5 loading buffer
2.2.6 PBST溶液
2.3 主要仪器
2.4 主要实验方法
2.4.1 组织基因组DNA的提取
2.4.4 琼脂糖凝胶电泳
2.4.5 鼠掌组织的石蜡包埋及切片
2.4.6 H&E染色
2.4.7组织的蛋白提取
2.4.8蛋白质免疫印迹
2.4.9 冰冻切片
2.4.10 免疫荧光染色
2.4.13 凝胶回收
2.4.14 动物组织透射颠镜
2.4.15 慢病毒包装
2.4.16 慢病毒感染目标细胞构建稳转细胞系
2.4.17 流式细胞仪检测
2.4.18 细胞培养
2.4.19 细胞传代
2.4.20 质粒抽提
2.4.21 小鼠饲养
2.4.22 统计学处理
3 实验结果
3.1 CRISPR/Cas9系统的构建
3.1.1 sgRNA的设计及初步优化
3.1.2 CRISPR/Cas9 系统载体的选择
3.2 细胞验证CRISPR/Cas9系统作用效果
3.2.1 Krt9/c.434delAinsGGCT 突变与萤光素酶共表达敲入细胞验证 CRISPR/Cas9系统作用效果
3.2.2 Krt9/c.434delAinsGGCT突变杂合与荧光共表达敲入细胞的构建验证CRISPR/Cas9系统作用效果
3.3 EPPK模型小鼠验证CRISPR/Cas9系统作用效果
3.3.1 Krt9/c.434delAinsGGCT 突变敲入小鼠的基因型鉴定
3.3.2 EPPK 模型小鼠的 CRISPR/Cas9 治疗
3.4 EPPK模型小鼠验证CRISPR/Cas9系统的脱靶效应
4 结论
5 讨论
参考文献
综述:CRISPR/Cas系统分类的前世今生
附录
作者简历及在学期间所取得科研成果