重组罗伯茨绿僵菌光解酶的构建及功能研究
紫外线（UV）辐射会对人类造成许多危害，包括引起皮肤黑化和光老化，以及引发急性晒伤和色素沉着在内的表皮损伤等。在细胞水平上，UV辐射导致最主要的DNA损伤是两种光产物，即环丁烷嘧啶二聚体（CPD）和嘧啶-嘧啶酮（6-4）光产物（6-4PPs）。CPD损伤是UV辐射导致细胞死亡的主要细胞毒性病变，人类细胞需要一套非常复杂的修复系统来清除核DNA上的CPD。然而在微生物、植物和少数动物中存在CPD光解酶，单个的CPD酶自身在可见光激活后可以直接修复DNA上的CPD，具有简单高效的特点。为了能用CPD光解酶修复人类核DNA上的CPD，本研究基于微生物和目前已知的唯一来自于哺乳动物的CPD光解酶，创建一种能自动进入人类细胞核修复UV辐射所产生的CPD损伤的重组光解酶。主要取得了如下研究结果： 1）我们验证了AE1（果蝇触角同源结构域蛋白的第三个螺旋结构）、TE1（HIV-反式转录激活因子蛋白的49~60位氨基酸残基）两种细胞穿透短肽都能携带重组蛋白跨膜转运至人类细胞内的功能。在此基础上，通过筛选入核信号肽，以及入核信号肽、细胞穿透多肽和目标蛋白的排列顺序，构建了能将外源蛋白跨膜转运进细胞并定位至细胞核的重组蛋白结构模型（SVNLS-targetprotein-AE1），其中SVNLS为猿猴病毒40的核定位信号。 2）根据上述所得到了重组蛋白结构模型（SVNLS-targetprotein-AE1），我们构建了来自长鼻袋鼠和自然界广泛分布的罗伯茨绿僵菌的CPD光解酶的重组蛋白表达载体。其中长鼻袋鼠的CPD光解酶的重组蛋白SVNLS-PtPL-AE1未能在大肠杆菌中表达，但成功表达了罗伯茨绿僵菌的CPD光解酶（MrPHR1）的重组蛋白SVNLS-MrPHR1-AE1，并通过优化得到了重组蛋白SVNLS-MrPHR1-AE1的最佳表达诱导条件和纯化条件：诱导蛋白表达温度为10℃~20℃；纯化过程使用pH7，盐离子浓度为300mMNaCl的缓冲液（包括lysisbuffer，washbuffer和elutebuffer）。 3）发现人皮肤成纤维细胞HFF-1经1J/m2UV辐射后，细胞内核DNA中的CPD含量上升约150倍，随后经可见光照射后CPD含量无明显变化；与之相比，与SVNLS-MrPHR1-AE1重组蛋白孵育的细胞经UV辐射和可见光照射（激活SVNLS-MrPHR1-AE1蛋白）后核DNA上的CPD含量下降了35%。 4）紫外线除了直接作用于细胞的DNA产生CPD等DNA损伤，还能诱导细胞产生活性氧（ROS）进一步引发DNA损伤。而ROS还可作用于脂质中的不饱和脂肪酸，生成过氧化脂质，并且后者可逐渐分解为包括剧毒分子丙二醛（MDA）在内的一系列复杂的化合物，毒害细胞。我们发现，普通的HFF-1细胞经UV辐射后胞内ROS水平上升2.3倍、MDA水平上升5.4倍。而与SVNLS-MrPHR1-AE1重组蛋白孵育的细胞经UV处理后产生的ROS含量在经白光照射后下降到与未经UV处理的细胞相当的水平，而MDA含量也下降了2倍。 5）超氧化物歧化酶（SOD）作为一种氧自由基清除剂，可以有效清除细胞内的ROS，以保护细胞。HFF-1细胞经UV辐射后细胞内SOD活性上升2.7倍，而与SVNLS-MrPHR1-AE1重组蛋白共孵育的细胞经可见光照射处理后，细胞内SOD活性进一步上升，达到未经UV处理的细胞的4倍。重组蛋白SVNLS-MrPHR1-AE1能提高经UV处理的细胞内SOD酶活性可能是它能降低这类细胞内ROS水平的一个原因。 综上，本研究成功构建、表达和纯化制备了罗伯茨绿僵菌的CPD光解酶的重组蛋白SVNLS-MrPHR1-AE1。该重组蛋白能跨越细胞膜和核膜进入人类HFF-1细胞的细胞核内清除由UV辐射诱导产生的核DNA的CPD，并能有效降低UV辐射诱导产生的氧自由基和毒性物质丙二醛的水平，以及提高被UV辐射的细胞内的SOD酶活性。因此，基于真菌CPD光解酶的重组蛋白SVNLS-MrPHR1-AE1在修复和预防UV辐射对人类细胞造成的损伤方面有较好的应用价值，同时提供了一种将外源蛋白带入人类细胞核的有效的方法。
重组罗伯茨绿僵菌光解酶;紫外线辐射;CPD损伤;修复效果
浙江大学
硕士
微生物学
方卫国
2022
中文
R979.6
2023-02-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）