希瓦氏菌细胞色素c前体氧化还原途径的研究
细胞色素c（cytc）是一类血红素蛋白，几乎存在于所有生命中，主要作为电子载体或末端还原酶参与细胞的能量代谢过程如呼吸作用。与高等真核生物相比，细菌通常拥有多种细胞色素c以支持它们呼吸各类非氧电子受体，这对于它们在自然界复杂环境中的生存至关重要。以呼吸多样性闻名的希瓦氏菌（Shewanella）属无疑是其中最著名的代表，其研究模式菌株奥奈达希瓦氏菌（Shewanellaoneidensis）编码多达42种细胞色素c。 在革兰氏阴性菌中，细胞色素c的生物合成依赖于一个复杂的翻译后修饰步骤称为细胞色素c的成熟，即细胞色素c蛋白质前体（apocytc）在细胞质翻译后进入周质空间，在细胞色素c成熟系统的催化下与血红素（heme）共价结合，成为具有功能的成熟蛋白。与heme结合之前，apocytc首先在巯基/二硫键氧化还原酶蛋白家族（Dsb）的作用下经历一个氧化还原过程：其血红素结合位点（通常为Cys-X-X-Cys-His）的两个半胱氨酸会被DsbA迅速氧化形成二硫键，以稳定apocytc的结构防止被蛋白酶降解，只有在DsbD提供还原力将二硫键打开后，apocytc才能与heme共价结合。S.oneidensis基因组编码多个DsbA，但DsbD却是唯一的；这意味着一旦DsbD功能丧失会造成细胞色素c成熟完全受阻，严重影响呼吸能力，导致细胞在无氧环境中很难生存。尽管细胞色素c成熟系统已被研究多年，但对于apocytc二硫键氧化还原过程的系统研究仍相当匮乏。本论文以S.oneidensis为研究模式菌，探究了DsbD缺失时细菌可能存在的自我拯救机制，系统揭示了apocytc的多种氧化还原途径及其作用机制。 本论文以确定S.oneidensisDsb蛋白对细胞色素c成熟的必要性为出发点。首先，在有氧生长条件下，DsbD缺失突变株（ΔdsbD）完全不含细胞色素c，表明DsbD对细胞色素c成熟是不可或缺的。其次，研究显示S.oneidensis中有3种DsbA参与apocytc的氧化，由于表达量及活性位点的差异，它们对apocytc的氧化贡献不同。将dsbA全部敲除（ΔdsbA1-3）时，与野生型相比细胞色素c含量仅降低约10%，说明除DsbA外还存在其他能够氧化apocytc的氧化剂，推测是氧气和培养基中的小分子氧化剂等。进一步研究发现ΔdsbD丢失所有dsbA时（ΔdsbA1-3ΔdsbD）细胞色素c含量能够恢复至野生型的30%，表明一部分细胞色素c蛋白前体不依赖于DsbA/DsbD的氧化还原，可以直接进入细胞色素c成熟系统。另外，论文还对负责维持DsbA氧化活性的DsbB蛋白展开功能研究，发现其缺失与同时敲除3种DsbA的效应迥异；敲除DsbB对野生型和ΔdsbD的细胞色素c几乎无影响，氧化还原反应测定印证了S.oneidensis的DsbA几乎不依赖于DsbB的再氧化。由于S.oneidensis缺乏DsbB的功能替代蛋白，这些结果表明在S.oneidensis中存在新的DsbA蛋白再氧化机制。 无氧条件下，几乎所有呼吸通路都依赖于细胞色素c，因此ΔdsbD难以生存。基于以上发现，论文尝试回答一个关键问题：在DsbD功能缺失时，细菌是否可以利用更多的策略使apocytc处于非氧化状态，从而不依赖于DsbD的还原而获得成熟？研究发现与有氧条件下相比，氧气的缺失能够使ΔdsbA1-3ΔdsbD进一步恢复约10%野生型水平的细胞色素c，证明氧气的确是apocytc的氧化力来源之一。此外，研究还比较了不同培养基（基本或复合，例如LB）对ΔdsbA1-3ΔdsbD细胞色素c含量的影响：在无氧培养时，基本培养基可使ΔdsbA1-3ΔdsbD的细胞色素c含量得到显著提升，恢复至野生型的50%，暗示LB培养基含有能够氧化apocytc的氧化剂。为了验证剩余的这部分细胞色素c是否因为缺乏稳定的二硫键结构而被降解，我们检测了外源添加小分子还原剂如L-半胱氨酸或还原型谷胱甘肽的作用。令人惊讶的是，这些还原小分子能够进一步促进约30%的细胞色素c成熟，这表明体系中仍存在能够氧化apocytc的未知氧化剂。鉴于培养基等非细胞因素已经排除，我们推测这些氧化剂由细菌自主产生。此外，通过内源途径提高周质的小分子还原剂浓度，例如过表达位于内膜上的小分子还原剂转运蛋白等，不能起到外源添加的效果，表明ΔdsbD可以利用外界环境中的小分子还原剂，但难以通过调控自身小分子还原剂的分布来提供还原力。这些结果综合证明了S.oneidensisapocytc氧化途经具有很高的多样性和复杂性。 在研究过程中，我们意外发现无氧条件下培养的ΔdsbD在48小时延滞期后开始缓慢生长，细胞色素c的成熟也部分恢复。研究表明，这一令人惊讶的现象与该菌负责呼吸调控的全局转录因子cAMP-CRP的活性增强相关。通过转座子筛选发现产生上述现象的根本原因是cAMP浓度升高激活了CRP，进而诱导了硝酸还原酶亚基NapB的大量表达。NapB本身就是一种细胞色素c蛋白，因此它发挥上述功能的前提是apo-NapB能够在DsbD缺失时获得成熟。基于在有氧条件下，无论是外源提高cAMP浓度还是过表达NapB都不能恢复ΔdsbD细胞色素c成熟，我们推测无氧条件下少量的apo-NapB能够设法逃脱氧气的氧化，从而不依赖于DsbD的还原。深入探究揭示，与DsbD一样，NapB通过将电子传递给细胞色素c成熟系统来还原apocytc，从而弥补了DsbD的功能。此外，通过系统发育分析发现，Shewanella的NapB和其它细菌中的同源蛋白形成了两个不同的进化枝α-和β-NapB，其中β-NapB占极少数，而S.oneidensis仅含有β型。通过异源回补多个细菌的α-和β-NapB，发现只有β-NapB可以拯救ΔdsbD。 综上所述，本研究一是揭示了S.oneidensis进化出复杂的氧化路径以促进apocytc的迅速氧化，最大程度避免其被蛋白酶降解；二是研究了DsbD缺失时细菌可以采用的多种策略，首次发现了无氧条件下NapB能够恢复ΔdsbD的细胞色素c成熟，并阐明了其发生和作用机制，揭示了一种细菌适应自然界的自我拯救策略。
希瓦氏菌;细胞色素c前体;氧化还原途径;自我拯救策略
浙江大学
博士
微生物学
高海春
2022
中文
Q939.1
2023-02-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）