希瓦氏菌周质细胞色素c在亚硫酸盐氧化及胞外电子传递过程的功能研究
细胞色素c（c-Cyt）是一类血红素（heme）辅因子以共价方式与蛋白多肽链连接的蛋白质，作为电子载体和氧化还原酶广泛地参与生物体能量的传递过程，如呼吸作用与光合作用。希瓦氏菌（Shewanella）是一类兼性厌氧的革兰氏阴性菌，具有异乎寻常的呼吸（电子受体还原）多样性，在生物能源和环境生物修复方面应用前景广阔。这主要归因于这类菌编码数量众多、功能各异的c-Cyts，例如该属中的研究模式，奥奈达希瓦氏菌（Shewanellaoneidensis）编码42种c-Cyts。目前对于S.oneidensis参与多种呼吸通路的c-Cyts的作用已经有了一定的了解，约占总数一半的c-Cyts的功能和生理影响已经或多或少得到研究。然而，截止目前，对于剩余一半的功能认知还处于空白的阶段，尤其对是那些存在于细胞周质且分子量较小也不具有催化活性的c-Cyts如何影响细胞生理更加一无所知。本论文对未知功能的周质小c-Cyts展开研究，包括针对性地解析具体c-Cyts参与的代谢通路和其发挥的功能，和探究这些c-Cyts组成的周质网络对S.oneidensis最具特征的呼吸基础—胞外电子转移（EET）的影响。 通过对S.oneidensis编码的未知功能c-Cyts进行归纳分析，发现3个c-Cyts的编码基因在基因组上紧邻，其基因注释均为亚硫酸盐脱氢酶血红素亚基。亚硫酸盐是一种化学性质活泼的含硫无机化合物，可作为多种微生物呼吸的电子受体。S.oneidensis的亚硫酸盐还原能力及其相关电子传递和催化蛋白系统早已被确定，但目前仍不清楚该菌是否能够催化亚硫酸盐的氧化。本研究发现，S.oneidensis通过一种非典型的周质亚硫酸盐脱氢酶氧化亚硫酸盐，在氧气存在的情况下，亚硫酸盐的氧化优先于其还原。这种非典型的亚硫酸盐脱氢酶由一个高度保守的催化亚基与3个单血红素c-Cyt亚基组成。3个c-Cyt电子传递亚基将从亚硫酸氧化获得的电子通过细胞色素cbb3氧化酶（负责氧气呼吸的关键酶）最终传递给氧气，该过程对于亚硫酸盐的氧化必不可少。基因组学分析表明，这种类型的亚硫酸盐脱氢酶在细菌中十分少见，仅存在于Shewanella、弧菌（Vibrio）等5个属的细菌中。研究进一步揭示S.oneidensis的细胞色素bd氧化酶（负责氧气呼吸的辅助酶）对亚硫酸盐非常敏感，这一发现给细菌细胞色素bd氧化酶对抗环境胁迫的机制的理解增添了一个新维度。 S.oneidensis自发现以来，就以其具有EET能力而闻名。然而，EET的低效已经成为该菌作为电活性生物催化剂在生物电化学系统应用（尤其是微生物燃料电池）的主要瓶颈。目前已经明确周质c-Cyt网络在调节EET效率方面发挥着关键作用，但一直以来对于该网络在如何影响电子转移活性方面的认知仍然比较模糊且片面。本研究系统地分析了周质c-Cyt网络组成组分单独过表达或者缺失对EET效率的影响，发现cctA的过表达会加快从CymA（EET内膜电子传递中枢）和Mtr（EET外膜复合体）系统的电子转移速率。与之相反，napB、fccA和tsdB的过表达会严重损害EET，使得野生型（WT）的EET效率降低50%以上。基于上述研究结果我们构建了一系列fccA、napB和tsdB的单一或者多重突变株，并通过在这些菌株中过表达cctA，获得能够显著提升EET效率的周质c-Cyt网络最优化菌株。该菌株在MFC中的最大功率密度达到436.5mW/m2，约为WT最大功率密度的3.62倍。这些工作揭示了优化周质c-Cyt组成是提高EET效率的实用策略，说明深入了解参与EET的c-Cyts的生理和电化学特性十分必要。 综上所述，本研究一是解析了S.oneidensis3个未知功能c-Cyts的生理作用，阐明了它们组成的亚硫酸盐氧化途径和电子传递特征。二是确定了由小分子量c-Cyts组成的周质氧化还原网络是调节细菌EET效率的重要节点。这些成果一方面拓展了当前对具体c-Cyt功能与生理作用的理解，另一方面通过揭示同类型c-Cyts功能上存在的促进与竞争关系，为周质c-Cyts进行合理优化以增强EET效率提供参考。
希瓦氏菌;周质细胞色素c;亚硫酸盐氧化途径;胞外电子传递特征
浙江大学
博士
微生物学
高海春
2022
中文
Q939.1
2023-02-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）