Glutamicibacter nicotianae ZM05与互作菌降解邻苯二甲酸二丁酯的抗逆强化机制研究
邻苯二甲酸酯（Phthalicacidesters,PAEs）是一类典型的土壤污染物，广泛用作增塑剂，因其具有致突变性、致畸性和致癌性，已被中国国家环境监测中心和美国环境保护署列为优先污染物。邻苯二甲酸二丁酯（Dibutylphthalate,DBP）是最常用的PAEs之一，由于不会和塑料聚合物发生化学键合，很容易扩散到土壤和水体中，进而造成环境污染。本论文从农膜长期覆盖的土壤中富集筛选得到一株高效DBP降解菌GlutamicibacternicotianaeZM05，为微生物降解DBP的修复应用提供了种质资源。 然而，土壤中存在许多非理想因素，如酸碱性失衡、重金属含量过高、盐渍化等，无法达到细菌发挥最佳降解性能所需的最优条件。降解菌ZM05能够在最适条件下高效降解DBP，但环境胁迫严重影响了其在实际环境中的生物修复能力。由降解菌和互作菌构成的复合菌群可以帮助降解菌缓解环境胁迫。因此，构建高效复合菌群并明确其中的互作机制对DBP污染土壤的实地修复具有重要意义。本研究以DBP降解菌G.nicotianaeZM05为研究对象，通过高通量测序、共现网络分析、共培养实验及宏转录组学技术定向分离菌株ZM05在不同逆境下的互作菌，复配获得高效降解复合菌群并探究互作机制，主要研究结果如下： （1）从长期农膜覆盖的土壤中富集筛选得到一株DBP高效降解菌G.nicotianaeZM05，对其DBP降解性能、抗逆能力、降解底物谱和代谢通路等进行研究。菌株ZM05能够在24h内完全降解1,000mg/LDBP，较已报道的降解菌具有更高的DBP降解能力；利用HPLC-MS检测出多种中间代谢产物并结合中间产物利用实验，推测菌株ZM05通过水解和β-氧化两种途径将DBP转化为邻苯二甲酸（Phthalicacid，PA）后经原儿茶酸（Protocatechuicacid，PCA）途径最终矿化；菌株ZM05具有短链PAEs底物降解广谱性，能够降解邻苯二甲酸二丙酯（Dipropylphthalate，DPRP）、邻苯二甲酸二乙酯（Diethylphthalate，DEP）、邻苯二甲酸二甲酯（Dimethylphthalate，DMP）；此外，菌株ZM05能够在高浓度底物下高效降解DBP，但缺乏对重金属及低pH的抗逆能力。 （2）通过添加外源DBP降解菌ZM05进行土壤微宇宙实验，探讨了DBP对细菌群落结构和细菌间相互作用的影响，分离得到酸性胁迫下菌株ZM05的有效合作菌株。16SrRNA基因测序分析表明，DBP污染降低了微生物群落多样性，削弱了微生物之间的潜在相互作用，表现为共现网络中的连接较少，平均度较低，平均聚类系数较低。此外，菌株ZM05的子网络显示DBP改变了菌株ZM05与其他微生物之间的相互作用。根据网络预测，分离出非降解菌PseudomonasaeruginosaZM03，并通过共培养实验证明，在酸性胁迫下，菌株ZM03与菌株ZM05构成的复合菌群在降解DBP时具有正相互作用。 （3）通过添加外源DBP降解菌ZM05进行了土壤微宇宙实验，阐明了DBP-Cd复合污染对微生物群落的影响。结果表明微生物群落通过调整其组成、相互作用和功能以适应DBP-Cd胁迫。DBP和Cd复合污染降低了微生物群落的稳定性，具体表现为多样性降低、网络简化和生态位减少。微生物之间的相互作用增强，具体表现为微生物通讯相关的途径富集。基于共现网络的预测，定向分离得到非降解菌CupriavidusmetalliduransZM16，并通过共培养实验证明在Cd胁迫下菌株ZM16与菌株ZM05存在正相互作用。菌株ZM16可利用DBP降解下游代谢物缓解产物抑制，并吸附Cd缓解毒性应激。 （4）在降解菌ZM05与非降解菌ZM03的共培养体系中，菌株ZM03可利用下游酸性代谢物缓解酸抑制，加速降解过程。qPCR显示菌株ZM03在共培养中具有明显的生长速率优势，其相对丰度远高于菌株ZM05。而群体感应（Quorumsensing，QS）敲除株ZM03ΔlasR在共培养中的丰度优势显著丧失，表明QS在菌株ZM05和菌株ZM03降解DBP过程中发挥作用。进一步研究表明，菌株ZM03的lasR缺失导致共培养体系菌株比例改变、生长及降解能力下降、生物膜生物量下降、体系中信号分子及信号分子下游毒力因子浓度下降；通过对转录组数据进行分析，发现lasR的敲除导致了菌株ZM03中包括合成鼠李糖脂、弹性蛋白酶等毒力因子在内的多数群体感应相关基因的表达下调，而毒力因子的减少可能是ZM03敲除株竞争优势受损的主要原因；同时，lasR的敲除导致了ZM05中DBP代谢基因的表达下调，推测这是共培养体系降解能力下降的主要原因。 本文探究了降解菌G.nicotianaeZM05在土壤环境及两菌株的摇瓶环境中与互作菌降解DBP的抗逆互作强化机制，从复杂的微生物群落中定向分离了酸胁迫及镉逆境下的协作菌，构建了高效复合菌群，并解析了复合菌群中降解菌与协作菌的互作机制，以上研究为人工降解菌群的构建提供了理论基础，对增塑剂的实地修复具有指导性意义。
复合菌群;降解菌;互作菌;邻苯二甲酸二丁酯;抗逆强化机制
浙江大学
博士
微生物学
吕镇梅
2022
中文
X172
2023-02-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）