StMLP1调控马铃薯青枯病抗性的功能鉴定
由青枯菌（Ralstoniasolanacearum）引起的青枯病是威胁马铃薯产业的一种土传性维管束病害。青枯菌能从植物根部的自然孔口、伤口等位置进入植物的木质部中，随水分向上运输或吸附在导管内壁。它既能释放效应蛋白导致植物免疫水平下降，又能生长成聚集体阻塞导管，最终植物由于免疫系统的紊乱和缺水而萎蔫死亡。青枯菌的复杂多变以及马铃薯的高度杂合使得马铃薯抗青枯病育种的工作举步维艰，最为绿色有效的育种方式就是充分利用马铃薯的种质资源，从中筛选或创制出新的抗病材料。但是目前很难筛选到高抗青枯病的马铃薯材料，更难以克隆到抗青枯病基因，所以研究者们把研究方向集中在寻找抗性相关基因和解析植病互作机制上。Kunitz胰蛋白酶抑制剂（KunitzTrypsinInhibitors，KTIs）是蛋白酶抑制剂中研究较多的一个大家族，在植物抗逆方面能发挥一定作用。本课题组前期筛选到的一个Miraculin-likeprotein（MLP），它具有完整的保守Kunitz结构域，属于KTIs，但其在马铃薯与青枯菌互作中的功能及作用机制尚不清楚。本研究系统分析了该MLP调控马铃薯青枯病抗性的功能，以期从新的角度为马铃薯的青枯病抗性育种提供理论基础。主要结果如下： 1.StMLP1受青枯菌诱导后在马铃薯的维管束中特异性表达。 序列分析结果表明该MLP与番茄的Lemir具有较高的同源性，在拟南芥的7个KTIs中，它与AtKTI1具有更高的同源性，于是根据拟南芥中的命名规则，将其命名为StMLP1。通过分析StMLP1在马铃薯中的基因表达模式，发现该基因在正常情况下并不表达，而接种青枯菌后，根和茎中基因表达量随着青枯菌的侵染程度加深而逐渐提高，表明StMLP1能响应青枯菌侵染。对启动子序列进行比对分析发现，除了一些与生物胁迫相关的重要元件，还存在一个保守的维管束特异表达序列。在烟草叶片上瞬时表达OE-ProMLP::GUS，然后进行GUS染色，叶脉区域显蓝，表明该启动子能驱动GUS在叶脉中的表达，初步证明StMLP1的启动子具有维管束特异表达的功能。将超量表达OE-ProMLP::GUS的马铃薯株系进行GUS染色，结果显示其主要在植株的茎部和根部显蓝，进一步证明StMLP1启动子具有驱动基因在维管束特异性表达的功能。 2.StMLP1是一个负向调控马铃薯青枯病的蛋白酶抑制剂，信号肽对其在细胞内的正确定位具有重要的作用。 通过原核表达纯化得到了去除信号肽后的StMLP1融合蛋白，然后对其进行了胰蛋白酶抑制剂活性检测，结果表明StMLP1可以抑制胰蛋白酶的活性。在亚细胞定位的实验中，通过观察荧光信号发现，StMLP1保留信号肽时，蛋白主要在细胞膜附近；去掉信号肽后，大量的蛋白聚集在核内。这表明信号肽对于StMLP1蛋白在正确位置上行使功能具有重要作用。为进一步开展功能鉴定工作，本研究对StMLP1超量和干涉株系进行青枯菌接种鉴定，实验结果表明超量株系对青枯菌的抗性显著下降，而干涉株系对青枯菌的抗性显著提升。这说明StMLP1负向调控马铃薯对青枯病的抗性。 3.StMLP1参与调控马铃薯青枯病的抗性通路。 以StMLP1的马铃薯超量表达株系为材料，野生型E3为对照，取根部样品进行RNA-Seq。分析获得了一些马铃薯差异表达基因，GO和KEGG富集到了多个与植物免疫相关通路的基因，与E3相比超量株系中这些基因显著上调表达，表明StMLP1可能参与这些通路来调控马铃薯对青枯病的抗性，但是其中的互作机制还需要进一步的验证。
马铃薯;青枯菌;胰蛋白酶抑制剂;抗性机制;StMLP1
华中农业大学
硕士
蔬菜学
陈惠兰
2022
中文
S435.32
2023-02-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）