Bacillus subtilis芽胞及Argonaute系统用于环境污染物检测的研究
生物材料、生物技术地开发在环境治理、临床诊断及工业生产中具有十分重要的意义。本研究开发了一系列基于Bacillussubtilis(B.subtilis)芽胞、PyrococcusfuriosusArgonaute(PfAgo)系统的生物传感方法和技术并用于环境污染物检测。主要研究内容如下： 一、建立了芽胞/鲁米诺化学发光体系与草甘膦氧化酶降解体系相结合的新型草甘膦检测方法。首先，甘氨酸氧化酶能够降解甘氨酸，同时具有微弱的草甘膦降解活性。本工作以Bacilluscereus甘氨酸氧化酶作为原始材料，通过定向进化技术获得特异性降解草甘膦产生H2O2的氧化酶B5R18。相比于原始甘氨酸氧化酶，B5R18对草甘膦的催化效率、特异性常数、亲和增强因子分别提高了2.85×103倍、2.25×105倍、9.64×104倍。然后，发现B.subtilis芽胞CotA-laccase能够催化鲁米诺/H2O2体系产生化学发光信号。该方法实现了对H2O2检测，检测限为0.050μmolL–1(S/N=3)，检测范围为0.050–20μmolL–1(R2=0.99)。最后，结合上述研究，提出了基于B.subtilis芽胞的化学发光体系用于草甘膦检测，检测限为0.090mgL–1(S/N=3)，检测范围为0.090–75mgL–1(R2=0.99)。本方法具有特异性高、成本低、操作简单及环境友好的特点，具有良好的实际应用价值。 二、建立了基于芽胞/3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine(TMB)的F–检测方法。首先，发现F–对芽胞CotA-laccase的催化活性具有强抑制作用。由此，本工作开发了基于芽胞/TMB的可持式试剂盒用于F–定量和半定量检测。通过简单操作，本方法实现了对F–的高灵敏检测，检测限为0.90μmolL–1(3σ)，检测范围为5–600μmolL–1(R2=0.99)。本方法具有成本低、灵敏度高、特异性强、操作简单的优点，成功应用于地表水、地下水中F–浓度检测。最后，使用溶液酶法、光谱法等方法对芽胞CotA-laccase的F–抑制机理进行研究，得出F–通过与CotA-laccaseT2Cu位点结合，抑制了电子在三铜核心中(TNC)T2Cu与T3Cu的电子传递，最终抑制CotA-laccase还原态与氧化态之间的转化过程。 三、建立了基于芽胞/2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonicacid(ABTS)/o-dianisidinedihydrochloride(o-dianisidine)体系的pH检测方法。首先，发现芽胞CotA-laccase在酸性、中性、弱碱性条件下均表现出催化活性，并且具有pH敏感性。通过添加复合底物ABTS/o-dianisidine，本方法实现了对pH1.00–9.00地检测，并成功应用于地表水、土壤样品中的pH分析。此外，本方法还用于评估生肉的新鲜程度。最后，通过溶液酶法、光谱法等方法的研究分析，得出OH–通过同时与芽胞CotA-laccase的T1、T2Cu位点结合，影响了酶的电子传递过程，引起芽胞CotA-laccase催化活性地变化。 四、拟建立基于PfAgo的Hg2+检测平台。本工作率先提出将Ago系统应用于环境污染物检测。通过Aptamer识别、链置换恒温扩增、PfAgo的目的核酸识别过程，拟对Hg2+进行特异性检测。目前，正在对实验的可行性进行分析，下一步将对检测限、检测范围等进行深入研究。
环境污染物;检测方法;B.subtilis芽胞;Argonaute系统
华中农业大学
博士
微生物学
胡涌刚
2022
中文
X502
2023-02-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）