刺激响应释药型纳米药物的设计制备及其抗肿瘤应用
恶性肿瘤具有分子生物学复杂性和组织形态学异质性等特点，使得临床肿瘤治疗难以实现有效地遏制。全球每年恶性肿瘤新增病例和死亡病例仍不断攀升，是威胁人类健康的一大杀手。化疗是临床肿瘤治疗中最常规的方案，然而，小分子抗癌药物介导的化疗存在水溶性差、非靶病灶毒副作用大等问题，降低了药物的生物利用率和肿瘤治疗效果。常规的纳米药物制剂虽然能够增加药物的血液循环和在肿瘤处的富集；但是，由于其缺乏精准的药物释放机制，使得药物在递送过程中发生泄漏，仍会对正常细胞造成非特异性毒性。刺激响应释药型纳米药物以及纳米前药的出现，进一步提高了纳米药物的递送效率和靶点特异性释放能力。另一方面，单一药物难以实现足够的抑癌功效，因此多药联用有望获得协同抑制肿瘤生长和转移的效果。在本论文中，设计并构建了一种基于外源刺激和两种肿瘤微环境响应释药型纳米药物制剂，用于抗肿瘤协同治疗和多模式治疗。主要研究内容和结果如下： 1)光响应释药型纳米药物的制备及性能研究。以普鲁兰多糖为亲水性主链，在侧链通过共价连接光响应断裂的疏水基团（邻硝基苄基酯），形成两亲性的聚合物（P-ONB），与疏水性药物（DOX）共组装形成纳米载药系统（P-ONB/DOX）。利用FT-IR、MS和1H NMR验证了P-ONB结构的正确性，细胞毒性实验结果表明P-ONB具有良好的生物相容性；P-ONB/DOX的粒径分布均一，具有良好的胶体稳定性，在光照触发下呈现出快速解组装的行为；体外释药动力学结果表明光照刺激后的纳米载药载体显示出快速可控的释药功能；激光共聚焦扫描显微镜（LSCM）和流式细胞术（FCM）验证了P-ONB/DOX在光照刺激下具增强细胞内化和加速药物释放功能，细胞毒性实验证明了通过外源光照能够显著地提高P-ONB/DOX的细胞毒性（HeLa细胞株IC50值从5.60g/mL降至1.01g/mL）。因此，P-ONB作为一种具有良好稳定性和生物相容性的纳米载体，能够用于疏水药物的可控递送，结合光的优良特性，实现时空控制的药物释放，达到精准杀死肿瘤细胞的效果。 2)pH/还原双响应双前药纳米组装体的制备及性能研究。双前药纳米系统由喜树碱（CPT）前药聚合物和顺铂前药聚合物两部分组成。CPT前药聚合物以聚乙二醇-聚赖氨酸为主链，将CPT通过还原敏感的二硫键接枝到赖氨酸侧链上，并在侧链上引入具有在酸性环境下发生电荷反转的顺-乌头酸（CAA）基团；顺铂前药聚合物以阳离子树枝状大分子（G3-PAMAM-NH2）为母体，偶联还原敏感的四价铂药；两种前药聚合物能够通过静电作用和疏水双重作用共组装成双前药纳米组装体（NP(ss-CPTamp;Pt)）。实验结果显示NP(ss-CPTamp;Pt)具有良好的生物相容性和稳定性、长效血液循环时间和优异的肿瘤富集能力；利用MS、HPLC和纳米粒度仪验证了低pH（5.0）触发的电荷反转（-2.48mV转变为+7.5mV）和还原触发的CPT释放行为，以及纳米组装体在上述双触发下的解组装行为；体外释药结果显示NP(ss-CPTamp;Pt)在还原环境下表现出快速释放双药（CPT和Pt(Ⅱ)）的特性。LSCM观察到MCF-7细胞对NP(ss-CPTamp;Pt)的高效摄取，以及pH触发的电荷反转机制对于内涵体逃逸的重要贡献；细胞毒性、死活细胞染色和细胞周期分析确认了NP(ss-CPTamp;Pt)具有极强的肿瘤细胞杀伤力（IC50：3.18μM，无二硫键NP(cc-CPTamp;Pt)的IC50值约为49.20μM）和CPTamp;Pt双药协同作用；体内荷瘤小鼠（4T1）抑癌结果显示，NP(ss-CPTamp;Pt)表现出优异的肿瘤生长抑制效果（IR：92.1%）和理想的生物安全性。所以NP(ss-CPTamp;Pt)具有肿瘤微环境双重敏感可控释放特性，在协同治疗化疗耐性肿瘤方面具有良好的应用前景。 3)MMP2酶/还原双响应载siRNA纳米前药复合物的制备及性能研究。纳米前药复合物系统由阳离子CPT前药聚合物和阴离子siRNA两部分组成。CPT前药聚合物以叶酸-聚乙二醇-肽段-聚赖氨酸为主链，通过二硫键共价连接CPT分子，与阴离子的siRNA（siCD47和siPDL1）通过静电作用和疏水作用共组装成载siRNA纳米前药复合物（FNP(ss-CPTamp;siRNA)）。实验结果证明了FNP(ss-CPTamp;siRNA)具有良好的生物相容性、较强的基因负载和保护能力、长效血液循环和精准的肿瘤富集能力；利用纳米粒度仪和凝胶电泳实验验证了MMP2作用下的电荷反转（-2.14mV转变为+7.24mV）能力和还原环境下的CPT和siRNA释放行为；体外释药结果表明FNP(ss-CPTamp;siRNA)在还原环境下表现出快速释放药（CPT和siRNA）的特性，LSCM观察到在MMP2作用下电荷反转后能够增强细胞摄取和胞内运输行为；细胞毒性和死活细胞染色验证了MMP2预处理的FNP(ss-CPTamp;siRNA)具有更强的肿瘤细胞杀伤力（IC50值由1.47μM降至1.18μM）；通过qRT-PCR、Western Blot和免疫荧光染色证明了siCD47和siPDL1在mRNA和蛋白质水平的基因沉默能力；体内荷瘤小鼠（4T1）抑癌结果显示，FNP(ss-CPTamp;siCD47amp;siPDL1)表现出更强的肿瘤抑制效率（IR：66.7%）和良好的生物安全性。分子生物学研究表明，通过下调肿瘤中CD47和PDL1的表达，显著地增加肿瘤内CD68+巨噬细胞和CD4+、CD8+T淋巴细胞的浸润。所以，FNP(ss-CPTamp;siCD47amp;siPDL1)在肿瘤的化药和RNAi联用以调动化学免疫治疗方面具有良好的应用前景。
纳米药物载体;制备工艺;肿瘤微环境;刺激响应性;生物相容性
大连理工大学
博士
生物化工
王静云
2021
中文
R318.08
2023-02-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）