基于新酶的PHA体外合成途径构建及合成性能研究
聚羟基烷酸酯（Polyhydroxyalkanoates,PHAs）是一种由各种细菌和古细菌在限制营养和过量碳供应的不平衡生长条件下产生，在细胞内用作储存碳和能量。除了在自然界中完全可生物降解外，PHAs的机械性能和热性能几乎与石油基塑料相当，受到材料领域的诸多关注。然而，PHAs合成成本高于石油基塑料，可商品化的PHAs类型有限，使用新酶通过设计合成途径合成新型PHAs具有重要意义。 本研究以(R)-3-羟基丁酸[(R)-3-hydroxybutyricacid,(R)-3HB]、D-乳酸（D-lacticacid,D-LA）、4-羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoateacid,4HBZ）、(R)-扁桃酸[(R)-Mandelicacid,(R)-MA]为底物，利用分别来自Massiliasp.UMI-21的乙酰CoA合成酶ACSMU和PelotomaculumthermopropionicumJCM10971的ACSPt作为CoA供体合成酶，及分别来自Clostridiumdifficile的CoA转移酶HadACd和ClostridiumpropionicumJCM1430的PCTCp作为聚合前体HA-CoA合成酶，再利用分别来自Ralstoniaeutropha、Massiliasp.UMI-21的Ⅰ类PHA合酶PhaCRe、PhaCMU和来自Pseudomonassp.SG4502、Pseudomonasaeruginosa93-3-1的Ⅱ类PHA合酶PhaC1Ps(STQK)、PhaC1Pa93(STQK)作为前体聚合酶，构建不同的体外合成途径，探讨合成PHA的相关新酶合成能力及产物结构。 首先对设计途径中的相关酶进行了体外重组表达。将已有的四个重组菌株BL21-pCold-acsPtBL21-pQE-80L-phaC1Ps(STQK)，和新构建的四个重组菌株BL21-pQE-80L-acsMU、BL21-pColdⅡ-hadACd、BL21-pQE-80L-phaCMU、BL21-pQE-80L-phaC1Pa93(STQK)进行体外大量表达与纯化，获得蛋白浓度分别为（mg/mL）：ACSMU（6.2）、ACSPt（14.0）、HadACd（15.0）、PCTCp（12.0）、PhaCRe（16.0）、PhaCMU（6.4）、PhaC1Ps(STQK)（5.4）、PhaC1Pa93(STQK)（6.8）。 然后分析三类蛋白的底物特异性，ACSMU蛋白对CoA的比活力低于ACSPt的比活力；HadACd对(R)-3HB、D-LA、4HBZ、(R)-MA、(R)-HPBA均有酶活性，其中对4HBZ的活性最高，而PCTCp只对(R)-3HB、D-LA有酶活性；PHA合酶PhaCRe只对(R)-3HBCoA有酶活性，PhaCMU对(R)-3HBCoA、D-LACoA有酶活性，PhaC1Pa93(STQK)对(R)-3HBCoA、D-LACoA、4HBZCoA、(R)-MACoA、(R)-HPBACoA的酶活性均高于PhaC1Ps(STQK)。 最后，构建三条PHA合成途径，第一条使用酶组成ACSMU/ACSPt，PCTCp，PhaCRe，以(R)-3HB为底物，均能合成聚羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate,PHB），证明新酶ACSMU可以用于PHB的体外合成。第二条使用酶组成ACSMU，PCTCp，PhaCMU/PhaC1Ps(STQK)/PhaC1Pa93(STQK)，以摩尔比为100∶0、75∶25、50∶50、25∶75、0∶100的(R)-3HB、D-LA为底物，三种聚合酶均能合成PHB，且使用PhaCMU、PhaC1Pa93(STQK)合成PHB产量高于PhaC1Ps(STQK)。第三条使用酶组成ACSMU，HadACd，PhaC1Pa93(STQK)，以摩尔比为100∶0、75∶25、50∶50、25∶75、0∶100的(R)-3HB:4HBZ和(R)-3HB:(R)-MA为底物，两种不同比例的底物合成的产物均为PHB，未见4HBZ、(R)-MA组分掺入，证明三种新酶组合可合成PHB。
聚羟基烷酸酯;体外合成途径;酶活性;合成能力;产物结构
长春理工大学
硕士
生物工程
韩雪容
2022
中文
Q939.97
2023-02-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）