基于纳米磁珠的病原微生物核酸的快速提取研究
由病原微生物引起的疾病统称为感染性疾病，其中传染性强、能够引起传播的称为传染病，其大规模传播通常会引发公共卫生安全事件，甚至造成严重的危机，如2019年全球爆发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情已导致数亿人感染和数百万人死亡，对全球经济发展造成重创。快速、准确的检测病原微生物是防治诊断各类感染性疾病的重要措施，而快速获取高质量病原体核酸是保证核酸检测效率和准确性的前提。目前核酸提取方法存在着步骤繁琐、耗时长及提取过程所用有机试剂对人体产生毒性作用等问题。因此建立一种简单快速、核酸得率高的病原微生物核酸提取方法是必不可少的。 第一部分是巴斯德移液管--纳米磁珠（PasteurPipette--NanomagneticBeads，PPNB）核酸提取体系的建立。本研究首先将纳米磁珠与巴斯德移液管相结合，以鼠伤寒沙门氏菌为研究对象，采用课题组研发的新型快速核酸检测技术-加速链交换扩增（ASEA），对提取过程关键因素包括巴斯德移液管规格、磁珠类型与用量、裂解吸附条件、洗涤液组分及洗脱条件进行优化研究，最终建立了提取时间短（15min），回收效率高(93%-98%)，操作简单且无需电器设备的PPNB体系。 第二部分评估了PPNB针对不同类型的样本和病原微生物的适用性及ASEA对PPNB提取核酸产物的灵敏度。PPNB体系分别提取四种人工模拟样本包括SARS-CoV-2假病毒阳性咽拭子、金黄色葡萄球菌阳性血清、鼠伤寒沙门氏菌阳性牛奶及副溶血弧菌阳性猪肉，使用ASEA对PPNB提取的上述样本核酸产物进行扩增，结果表明PPNB体系适用于各种类型样本。同时针对ASEA对PPNB提取上述样本核酸产物的灵敏度进行分析，结果显示咽拭子中SARS-CoV-2假病毒检测限低至1.0×103copies/mL，血清中金黄色葡萄球菌、牛奶中鼠伤寒沙门氏菌及猪肉中副溶血弧菌检测限均低至10CFU/mL，这些数据表明PPNB体系在提取上述样本病原体核酸时，具有较强的浓缩和富集能力。此外使用PPNB提取从医院收集的30例临床样本，样本包括肺炎支原体阳性咽拭子、人乳头状瘤病毒16型阳性宫颈拭子及幽门螺杆菌感染患者的胃黏膜，使用ASEA对PPNB提取样本核酸产物进行扩增，扩增结果显示与医院诊断结果一致，进一步证明该提取方法针对不同类型的样本和病原微生物均适用，并且有望用于临床诊断。 第三部分比较分析了PPNB体系与磁珠商业试剂盒、离心柱商业试剂盒及煮沸法试剂盒提取核酸的能力、时间及提取过程所用设备。以三种细菌（金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌）为靶标，以超微量分光光度计及ASEA为检测手段评估每种方法提取核酸的能力。从DNA浓度与纯度分析，PPNB提取的核酸浓度高出上述三种试剂盒10-40ng/μL（10%-37%），且核酸纯度较高；另一方面ASEA针对PPNB体系提取核酸产物的平均Ct值比三种试剂盒提前2-5，进一步验证PPNB提取核酸能力较强。使用梯度稀释的金黄色葡萄球菌，测定ASEA对四种方法提取核酸产物的灵敏度，结果显示ASEA对PPNB提取核酸产物的灵敏度最高，检测限为10CFU/mL，表明PPNB体系从样本中浓缩富集靶标核酸的能力高于三种试剂盒。此外，与三种试剂盒相比，PPNB提取时间仅需15min，且全程在管内进行，不需转移液体等步骤，同时不需金属浴、涡旋混合仪、离心机等电器设备，实现了对病原微生物简便快速提取的目标。 本论文结果显示PPNB提取体系可适用于不同类型的样本和病原微生物核酸的提取，且回收效率高，提取效果好，15min内即可完成核酸提取，不需电器设备。这种快速、易行和高效的提取方法更有利于全球范围内的病原体核酸检测的应用。
新型冠状病毒肺炎;病原微生物;核酸提取;纳米磁珠
青岛大学
硕士
微生物学
石超
2022
中文
R563.104.65
2023-02-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）