大肠杆菌分泌表达烟酰胺单核苷酸合成途径酶及多酶催化体系优化
烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide mononucleotide，NMN）是一种天然存在的核苷酸，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的重要前体物质。目前NMN的主要合成方式包括化学法合成和生物发酵法、酶法合成。而在三种主要的合成方式中，酶法合成不产生手性化合物、环保高效，因而成为较优的合成方式。但相对昂贵的底物、高成本的酶制剂限制了酶法合成的推广应用。 本研究旨在利用大肠杆菌分泌表达NMN合成途径酶，并优化反应条件进行NMN的催化合成。具体研究结果如下： （1）分别成功构建以下三酶的大肠杆菌分泌表达菌株：Sulfurovum sp.FS06-10来源的烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nicotinamide phosphoribosyl transferase，Nampt，EC2.4.2.12，简称Sfnampt）、Thermococcus kodakarensis KOD1来源的磷酸核糖焦磷酸激酶（Phosphoribosyl phosphate synthase，Prs，EC2.7.6.1，简称Tkprs）及Escherichia coli K12来源的核糖激酶（Ribokinase，Rbks，EC2.7.1.15，简称Erbks）。将信号肽PelB与三酶分别融合表达，通过信号肽引导三酶分泌至胞外，在发酵上清液中可检测到Sfnampt、Tkprs、Erbks的酶活性分别约为1.1±0.1U/L、21.1±2.8U/L、29.5±2.7U/L。 （2）对三种分泌表达的酶进行酶学性质分析。在最适反应条件方面，Sfnampt的最适温度为45℃，最适pH为7.5；Tkprs的最适温度为50℃，最适pH为8.5；Erbks的最适温度为37℃，最适pH为5.5，且在pH5.0~8.5范围内可以维持80%以上的酶活性。在热稳定性方面，Sfnampt的热稳定性较差，在35℃下处理3h后，残余酶活性约为80%，而在40~55℃处理3h后，其残余酶活性不足60%；Tkprs的热稳定性良好，在40~60℃处理3h后，残余酶活性高于90%；Erbks的热稳定性良好，在25~40℃处理3h后，残余酶活性高于90%。 对三酶进行酶动力学分析。以NAM为底物，Sfnampt的Vmax为0.65±0.07μmol/(L*min)，Km为2.87±1.10μmol/L；以核糖-5-磷酸为底物，Tkprs的Vmax为2.37±0.10μmol/(L*min)，Km为25.48±5.22μmol/L；以核糖为底物，Erbks的Vmax为12.58±1.44μmol/(L*min)，Km为74.13±22.15μmol/L。与已表征的Nampt相比，本研究分泌表达的Nampt底物亲和力较差，可能会成为NMN合成的限制因素。Tkprs、Erbks与已表征的Prs、Rbks相比，其底物亲和力好，适合用于NMN的催化合成。 （3）将三种分泌表达菌株的发酵上清液作为分泌的粗酶，投入催化体系进行NMN的合成，并对催化体系进行优化。初步优化结果表明，最适反应条件为温度37℃、pH8.0；在三个底物中，ATP为体系中的关键因素，提高其在三个底物中的比例对NMN的合成有较大的促进作用。三酶中Sfnampt是催化NMN生成的限制因素，提升其在体系中的比例对NMN的合成有较大的促进作用。优化后的催化体系在7h的催化反应后可生成5.5μmol/L的NMN，以核糖为底物的转化率为5.5%，相比原始体系转化率提高71倍。
烟酰胺单核苷酸;酶法合成;微生物发酵;酶制剂;酶学性质
华南理工大学
硕士
药学
林影;吴新良
2022
中文
TQ28
2022-12-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）