基于病人肝癌肿瘤干细胞构建肝癌类器官的研究
肝癌作为复发率高、死亡率高的恶性肿瘤，治疗效果差的根本原因在于肝癌肿瘤干细胞的存在。肿瘤干细胞（CSCs）作为肿瘤的“种子细胞”，它的自我更新、分化、迁移、耐药等特性在癌症的发生发展过程中起着关键作用。但是CSCs在组织中含量稀少、分离困难，因此需要在体外对CSCs进行分离培养。肿瘤类器官作为肿瘤的临床前模型之一，与肿瘤细胞系和患者来源异种移植物相比，具有许多优势。因此建立肝癌CSCs来源的肝癌类器官模型对于研究肿瘤的发生发展机制和进行药物筛选以满足肝癌个性化治疗具有重要意义。 目的：建立体外培养肝癌CSCs的2D和3D培养方法，并且建立肝癌CSCs来源的肝癌类器官的肿瘤临床前模型。 方法：1、利用小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养细胞培养病人肝癌组织来源的肝癌CSCs；2、通过流式分析、实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）、免疫荧光染色鉴定肝癌CSCs中干性标志物的表达；3、皮下注射10个肝癌CSCs至免疫缺陷小鼠体内，验证CSCs的高致瘤性。4、通过改变明胶与透明质酸的质量比制备5种具有不同硬度、不同孔径的明胶-透明质酸水凝胶；5、对比3D培养的CSCs克隆的形态、大小、数量以及ALDH阳性率，优化维持干性的水凝胶；6、对猪肝组织进行脱细胞处理，并通过HE染色、DAPI染色、DNA含量检测分析脱细胞结果；7、通过天狼猩红染色、EVG染色和阿利新蓝染色鉴定脱细胞组织中保留的细胞外基质成分；8、使用猪肝脱细胞基质制备猪肝脱细胞基质水凝胶培养肝癌CSCs来源的肝癌类器官；9、HE染色和AFP免疫荧光染色对肝癌类器官进行表征；10、转录组测序分析猪肝脱细胞基质水凝胶和Matrigel培养的肝癌类器官的差异基因；11、Ki67免疫荧光染色对比两种肝癌类器官的增殖能力；12、通过Transwell迁移实验和RT-qPCR对比两种肝癌类器官的迁移能力；13、于类器官培养的不同时间点检测ALDH阳性率，检测肝癌CSCs的分化；14、索拉菲尼药物处理类器官，检验类器官药物筛选的应用。 结果：在本课题研究中，我们首先建立了在小鼠胚胎成纤维细胞上2D培养CSCs的方法，以及在明胶-透明质酸水凝胶中3D培养CSCs的方法。他们均能够维持肝癌CSCs的干性，并且可以扩增传代。此外，猪肝脱细胞后保留的细胞外基质通过自组装的方法制备得到了猪肝脱细胞基质水凝胶。我们以肝癌CSCs作为细胞源，以猪肝脱细胞基质水凝胶代替Matrigel培养了病人原代肝癌类器官。转录组测序结果表明，猪肝脱细胞基质水凝胶和Matrigel培养的肝癌类器官表达谱高度相似。之后通过对比猪肝脱细胞基质水凝胶和Matrigel培养的肝癌类器官，发现猪肝脱细胞基质水凝胶培养的肝癌类器官的增殖能力和迁移能力比Matrigel更强。最后，我们使用索拉菲尼对培养的肝癌类器官进行了药效评价，证明该类器官培养平台可以用于药物筛选。 结论：我们建立了肝癌CSCs的体外2D和3D培养方法，并以肝癌CSCs为细胞源，建立了使用脱细胞基质水凝胶代替Matrigel的肝癌类器官临床前癌症模型。在癌症模型的建立、个性化治疗等方面具有重要意义。
肝癌类器官;肿瘤干细胞;胚胎成纤维细胞;明胶-透明质酸水凝胶;脱细胞基质水凝胶;临床前模型
华南理工大学
硕士
药学
段玉友;古维立
2022
中文
R735.7
2022-12-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）