大肠杆菌合成抗酸模块的构建与应用
工业微生物在制造生物燃料、化学品和材料上发挥着重要作用，支撑着我国年产总值3000亿元的生物发酵产业，是绿色生物制造的两个“芯片”之一。在发酵过程中，酸性副产物会逐渐累积，使发酵环境的pH逐渐下降，产生的多种压力如酸压力、氧化压力等会损害菌株胞内的DNA、RNA以及重要酶系，导致工业菌株的生长与生产性能下降。尽管在发酵过程中添加氨水等碱性物质能一定程度解除酸压力带来的负面影响，但通过改造菌株的酸耐受性更具经济性。 利用合成生物学的模块化改造设计思路，构建适时适量调控的抗酸模块是提高菌株酸耐受性的有效方法。本论文首先通过定向进化，构建了基于酸响应asr启动子突变库，获得49个不同强度的酸响应启动子突变体（为野生型asr启动子强度的22%-133%），以控制抗逆基因的适时适量表达。进而，基于对抗酸机制的理解，从大肠杆菌上百个与抗酸相关的基因中挑选了抗酸基因gadE、周质空间分子伴侣基因hdeB、抗氧化基因sodB、katE共4个基因与4种强度的酸响应启动子组装构建合成抗酸模块。对832个含有合成抗酸模块的菌株通过中度酸压力（pH5.0）生长筛选，最终获得最优合成抗酸模块1124使菌株的终OD600为野生型的151%。通过多因素ANOVA分析，揭示了hdeB、sodB和katE是酸生长的关键基因，也提示了hdeB在提高大肠杆菌酸耐受性中的重要性。通过转录水平和生化分析，揭示了合成抗酸模块能有效降低胞内ROS水平，提高胞内质子消耗能力。 本论文建立了大肠杆菌抗酸模块逐级评估方法，对合成抗酸模块进行从实验室菌株、实验室培养基到工业菌株、工业培养基条件下的性能评估。前期在全自动生长曲线分析仪中，对908个合成抗酸模块在模式菌株进行中度酸生长评估。进而在微型生物反应器中，对性能较优的33个合成抗酸模块在赖氨酸生产菌株进行基于赖氨酸产量的发酵筛选。最后在1.3-L发酵罐中，筛选出产量最高的4个合成抗酸模块在赖氨酸生产菌株进行生产评估。筛选获得了最优合成抗酸模块3124，可有效提高赖氨酸生产菌株的酸耐受性。SC3124菌株在pH6.0条件下发酵的赖氨酸产量和糖酸转化率为69.3g/L和0.56g/g，与亲本菌株在中性条件下的水平相当（58.7g/L和0.53g/g），而且比亲本菌株在pH6.0条件下发酵有明显提高（60.3g/L和0.49g/g），具有较高的工业前景。 本论文研究构建了酸响应启动子库，构建了含有限4个基因构成的合成抗酸模块，并发展了抗酸模块逐级评估方法，实现了赖氨酸工业生产菌株抗酸性能的有效提升（耐受pH值下降1个单位），为提高工业微生物抗逆性的研究提供了新的思路，并且丰富了合成生物学元器件库。
赖氨酸;生物发酵;大肠杆菌;合成抗酸模块;定向进化;逐级评估
华南理工大学
博士
微生物学
林章凛
2022
中文
TQ922.3
2022-12-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）