CircRTN4在狼疮性肾炎肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质沉积中的作用及机制
肾小球系膜细胞过度增殖是狼疮性肾炎(lupusnephritis,LN)主要的病变特点之一。增殖的系膜细胞通过释放炎症因子、分泌细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)导致部分患者进展为肾小球硬化，严重影响预后。环状RNA(circularRNA,circRNA)是一种新型非编码RNA(noncodingRNA,ncRNA)，有特殊的环状结构，在基因表达的多级调控中发挥重要作用。近年来，在肾脏疾病中发现表达失调的circRNA，并通过调节多种生物学过程参与疾病的发生发展。然而，circRNA在狼疮性肾炎尤其在系膜细胞功能障碍中的潜在机制尚未阐明。 本研究在前期RNA芯片筛选结果的基础上，以狼疮性肾炎患者、两种狼疮模型鼠、永生化人系膜细胞系(humanrenalmesangialcells,HRMCs)和人髓系白血病单核细胞系(THP1)为研究对象，探明circRTN4在狼疮性肾炎系膜细胞增殖及ECM沉积中的作用及可能机制，为进一步阐明狼疮性肾炎的发病机制及寻求可能的治疗靶点提供实验依据。具体实验分为以下四部分： 第一部分CircRTN4调节狼疮性肾炎肾小球系膜细胞增殖与FN的表达 目的： 筛选并验证狼疮性肾炎系膜细胞中差异表达的circRNA，并探讨circRTN4在狼疮性肾炎系膜细胞增殖及ECM沉积中的作用及其调节纤连蛋白(fibronectin,FN)表达的确切机制。 方法： 1.以人系膜细胞系为研究对象，3例LN患者置换血浆(LNplasma)和3例健康志愿者血浆(controlplasma)为刺激物，收集细胞进行circRNA的芯片筛选，并通过real-timePCR及RNA荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)检测circRTN4在LN系膜细胞中的表达。 2.收集狼疮性肾炎活检肾组织和因肾癌手术切除的远端正常肾组织，RNAFISH检测肾小球circRTN4的表达；免疫组织化学检测CyclinD1和FN的表达。 3.以人系膜细胞系为研究对象，检测狼疮性肾炎中circRTN4对肾小球系膜细胞增殖水平及ECM沉积的作用及机制： ⑴根据circRTN4序列信息，设计3条siRNA并转染至HRMCs，real-timePCR检测敲低效率。 ⑵检测circRTN4对肾小球系膜细胞增殖和ECM沉积的影响：HRMCs随机分为四组：controlplasma组、LNplasma组、LNplasma+sicircRTN4组、LNplasma+siNC组，BrdU掺入法检测系膜细胞增殖水平，real-timePCR及westernblot方法检测FNmRNA及蛋白的表达。 ⑶通过circBase预测circRTN4的靶miRNA，TargetScan预测与FN结合的miRNA，二者取交集。选择可信度较高的3个miRNA(miR-607、miR-647、miR-513a-5p)构建mimic，系膜细胞中转染miRNAmimics或过表达circRTN4，real-timePCR及westernblot方法检测FNmRNA及蛋白的表达。 4.以293T细胞为研究对象，双荧光素酶报告基因实验证实circRTN4与miR-513a-5p及miR-513a-5p与靶蛋白FN的结合。 结果： 1.CircRTN4在狼疮性肾炎肾小球系膜细胞中表达升高： ⑴RNA芯片结果显示，LNplasma组中有804个circRNA上调和512个下调的circRNA(|FoldChange|≥2且P＜0.05)。 ⑵Real-timePCR证实hsa_circ_0054595(circRTN4)在LN系膜细胞中表达上调。 ⑶DNA凝胶电泳证实circRTN4的环状结构。 ⑷RNAFISH证实circRTN4主要定位于细胞浆。 2.CircRTN4在狼疮性肾炎患者肾小球中表达增高： RNAFISH结果显示，circRTN4在LN患者肾小球中表达明显增高，且定位于肾小球固有细胞的细胞浆。 3.CircRTN4调节LN时肾小球系膜细胞增殖及ECM沉积： ⑴免疫组织化学结果证实，狼疮性肾炎患者肾小球中CyclinD1与FN蛋白表达明显上调。 ⑵流式细胞术与BrdU结果显示，与controlplasma组相比，LNplasma组细胞增殖水平明显增加，而敲低circRTN4表达后增殖水平降低。 ⑶Real-timePCR与westernblot结果显示，与controlplasma组相比，LNplasma组FNmRNA与蛋白表达水平明显增加，而敲低circRTN4后下调FNmRNA与蛋白的表达水平。 4.CircRTN4通过结合miR-513a-5p调节FN蛋白的表达： ⑴生物信息学分析miR-607、miR-647、miR-513a-5p为circRTN4与FN共同结合的靶mircoRNA。Real-timePCR与westernblot结果显示，过表达miR-513a-5p可显著降低FN的mRNA与蛋白表达水平。 ⑵回复实验结果显示，miR-513a-5pmimics可显著降低FN的蛋白表达水平，而过表达circRTN4可逆转此效应。 ⑶双荧光素酶报告基因实验表明，miR-513a-5pmimics可以明显减弱含有FN3''UTR序列质粒的荧光素酶活性，将含有FN3''UTR序列突变后，miR-513a-5pmimics不能影响荧光素酶的活性；此外，miR-513a-5pmimics可以明显减弱含有circRTN4预测结合位点质粒的荧光素酶活性，将含有circRTN4预测结合位点序列突变后，miR-513a-5pmimics不能影响荧光素酶的活性。 结论： CircRTN4在狼疮性肾炎肾小球系膜细胞中表达上调，促进细胞增殖并且通过结合miR-513a-5p调节FN蛋白的表达。 第二部分敲低肾组织circRTN4表达改善狼疮鼠肾小球细胞外基质沉积 目的： 本部分研究以狼疮性肾炎小鼠BALB/c+P及MRL/lpr为研究对象，活体感染病毒技术沉默肾脏circRTN4的表达，验证circRTN4对FN的调节作用以及敲低circRTN4对狼疮性肾炎肾小球ECM沉积及肾功能的改善作用。 方法： ⑴8周龄雌性BALB/c小鼠以0.5mL/只单次pristane腹腔注射，24周后，检测小鼠血清抗ds-DNA水平、尿蛋白水平升高，并观察到淋巴肿大及关节病变后，确定成模。将成模的小鼠随机分为：狼疮组(BALB/c+Pgroup)，circRTN4腺相关病毒肾脏原位注射组(BALB/c+P+circRTN4-Rgroup)，腺相关病毒对照组(BALB/c+P+circNC-Rgroup)，每组6只；同周龄雌性BALB/c小鼠设为对照组。 ⑵24周龄雌性MRL/lpr小鼠随机分为：狼疮组(MRL/lprgroup)，circRTN4腺相关病毒肾脏原位注射组(MRL/lpr+circRTN4-Rgroup)，腺相关病毒对照组(MRL/lpr+circNC-Rgroup)，每组3只，同周龄雌性MRL/MPJ小鼠设为对照组。 CircRTN4腺相关病毒组和病毒对照组小鼠每侧肾脏进行原位注射腺相关病毒，6周后留取血液、收集24小时尿液标本后处死小鼠，留取双侧肾脏组织。Real-timePCR观察病毒沉默效果，生化试剂盒检测小鼠尿蛋白、BUN及Scr水平，HE、PAS及天狼猩红染色进行病理形态学观察，real-timePCR、westernblot和免疫荧光方法检测小鼠肾皮质FNmRNA及蛋白表达水平。 结果： 1.腺相关病毒感染技术有效敲低狼疮鼠肾皮质circRTN4的表达： Real-timePCR结果显示，BALB/c+P+circRTN4-R和MRL/lpr+circRTN4-R组小鼠肾皮质中circRTN4表达水平明显降低。 2.敲低肾组织中circRTN4改善狼疮鼠蛋白尿水平： ⑴与BALB/c组小鼠相比，BALB/c+P组小鼠24h蛋白尿水平、血肌酐及血尿素氮水平明显增加；而与BALB/c+P+circNC-R组相比，BALB/c+P+circRTN4-R组小鼠24h蛋白尿及血尿素氮水平显著降低，血肌酐水平无明显差异 ⑵与MRL/MPJ组小鼠相比，MRL/lpr组小鼠24h蛋白尿水平、血肌酐及血尿素氮水平明显增加；而与和MRL/lpr+circNC-R组相比，MRL/lpr+circRTN4-R组小鼠24h蛋白尿水平显著降低，血肌酐及血尿素氮水平无明显差异 3.敲低肾组织circRTN4表达可改善狼疮鼠肾小球细胞增殖和ECM沉积： HE染色显示，与BALB/c小鼠相比，BALB/c+P小鼠肾小球体积增大，细胞数增多；而BALB/c+P+circRTN4-R组小鼠肾小球体积增大和细胞数目增多有所改善。PAS与天狼猩红染色显示，与BALB/c组小鼠相比，BALB/c+P组小鼠肾小球系膜区明显增宽，胶原成分增多；而BALB/c+P+circRTN4-R组小鼠肾小球系膜区增宽水平降低，胶原成分减少。此外，在MRL/lpr鼠中呈现相似的结果。 4.敲低肾组织circRTN4的表达可降低狼疮鼠肾小球中FNmRNA及蛋白表达： Real-timePCR、westernblot和免疫荧光结果显示，与BALB/c和MRL/MPJ组小鼠相比，BALB/c+P和MRL/lpr组小鼠肾皮质FNmRNA和蛋白表达明显增加；而敲低circRTN4的表达后小鼠肾皮质FNmRNA和蛋白表达明显降低。 结论： 敲低BALB/c+P和MRL/lpr小鼠肾组织circRTN4表达后，可下调FN的表达水平，减轻狼疮性肾炎肾小球ECM沉积并改善肾功能。 第三部分单核细胞源性circRTN4以外泌体形式促进肾小球系膜细胞增殖与FN的表达 目的： 分析LN时单核细胞中circRTN4的表达，探讨单核细胞源性外泌体。 方法： 1.收集狼疮性肾炎活检肾组织和因肾癌手术切除的远端正常肾组织，免疫荧光检测肾组织中单核细胞浸润情况。 2.检测狼疮性肾炎时单核细胞外泌体对系膜细胞增殖和FN蛋白表达的影响： ⑴外泌体鉴定：透射电镜观察外泌体形态；westernblot方法检测外泌体标记蛋白CD9、CD63的表达。 ⑵使用PKH67标记的THP1外泌体孵育系膜细胞，免疫荧光方法检测系膜细胞摄取外泌体情况。 ⑶检测抑制单核细胞源性外泌体对系膜细胞增殖和FN表达的影响：使用GW4869预处理THP12h，5%controlplasma或LNplasma刺激8h，收集THP1培养上清制成条件培养基(LNplasmatreatedconationedmedium,LM)孵育系膜细胞，HRMCs随机分为control组、LM组、LMGW4869组、LMDMSO组，BrdU掺入法检测系膜细胞增殖水平；real-timePCR方法检测系膜细胞circRTN4和FN的表达水平；ELISA方法检测系膜细胞培养上清中FN的水平。 3.检测单核细胞外泌体中circRTN4对系膜细胞circRTN4表达水平的影响： ⑴5%controlplasma或LNplasma刺激THP18h，real-timePCR检测THP1、THP1外泌体和狼疮性肾炎患者外周血单核细胞中circRTN4的表达；RNAFISH检测circRTN4的表达及定位。 ⑵将THP1随机分为controlplasma组、LNplasma组，5%controlplasma或LNplasma刺激8h后，超高速离心分别提取两组培养上清中的外泌体，称为THP1exoCon，THP1exoLN。系膜细胞随机分为controlplasma组、LNplasma组、LNplasma+THP1exoLN组和LNplasma+THP1exoCon组，5%controlplasma或LNplasma刺激系膜细胞8h后，real-timePCR检测系膜细胞内circRTN4表达。 ⑶将THP1随机分为controlplasma组、LNplasma组、LNplasma+sicircRTN4组和LNplasma+siNC组，5%controlplasma或LNplasma刺激8h后，超高速离心提取培养上清中的外泌体。使用上述外泌体孵育系膜细胞8h后，real-timePCR检测系膜细胞内circRTN4表达。 结果： 1.狼疮性肾炎患者肾组织中存在单核细胞浸润： 免疫荧光结果显示，CD68阳性信号主要定位在细胞浆；与癌旁远端肾组织相比，狼疮性患者肾组织中CD68蛋白表达明显增加。 2.狼疮性肾炎时单核细胞源性外泌体促进肾小球系膜细胞增殖水平和FN的表达： ⑴外泌体鉴定 透射电镜观察外泌体为直径小于150nm的微小囊泡。Westernblot结果显示，外泌体标记蛋白CD9和CD63为阳性。 ⑵狼疮性肾炎时系膜细胞摄取单核细胞源性外泌体增多： 免疫荧光结果显示，与controlplasma组相比，LNplasma组系膜细胞中PKH67阳性信号明显增加，表明系膜细胞摄取的单核细胞源性外泌体增多。 ⑶抑制单核细胞外泌体合成与释放减少LM诱导的系膜细胞增殖： BrdU结果显示，与control组相比，LM组细胞增殖水平升高；使用GW4869抑制单核细胞外泌体的合成与释放之后，系膜细胞增殖水平降低。 ⑷抑制单核细胞外泌体合成与释放减少LM诱导的系膜细胞FN的表达： Real-timePCR及ELISA结果显示，与control组相比，LM组FN表达水平明显升高；GW4869可抑制由LM诱导的系膜细胞FN合成与分泌增加。 ⑸抑制单核细胞外泌体合成与释放减少LM诱导的系膜细胞circRTN4表达： Real-timePCR结果显示，与control组相比，LM组系膜细胞circRTN4表达增加；而LMGW4869组circRTN4表达显著降低。 3.单核细胞源性外泌体中circRTN4调节系膜细胞中circRTN4表达： ⑴Real-timePCR结果证实circRTN4在THP1、THP1外泌体和狼疮性肾炎患者单核细胞中表达上调；RNAFISH结果显示circRTN4主要定位于细胞浆。 ⑵Real-timePCR结果显示，与controlplasma组相比，LNplasma诱导系膜细胞中circRTN4表达水平升高；LNplasma+THP1exoLN组系膜细胞中circRTN4升高更明显。 ⑶Real-timePCR结果显示，与THP1exoCon组相比，THP1exoLN刺激组系膜细胞circRTN4表达明显升高；敲低单核细胞中circRTN4后则该效应减弱。 结论： 单核细胞源性外泌体中的circRTN4可被肾小球系膜细胞摄取，导致系膜细胞中circRTN4水平进一步上调，并伴有细胞增殖水平升高和FN的过度合成与分泌。 第四部分敲低单核细胞circRTN4表达改善狼疮鼠肾小球细胞增殖水平与细胞外基质沉积 目的： 本部分以狼疮性肾炎BALB/c+P及MRL/lpr小鼠为研究对象，活体感染病毒技术沉默外周血单核细胞中circRTN4的表达，验证单核细胞源性circRTN4对系膜细胞的影响及敲低单核细胞circRTN4对狼疮性肾炎肾损伤及肾功能的改善作用。 方法： ⑴8周龄雌性BALB/c小鼠以0.5mL/只单次pristane腹腔注射，24周后，模型鉴定方法同第二部分。将成模的小鼠随机分为：狼疮组(BALB/c+Pgroup)，circRTN4腺相关病毒尾静脉注射组(BALB/c+P+circRTN4-Vgroup)，腺相关病毒对照组(BALB/c+P+circNC-Vgroup)，每组6只；同周龄雌性BALB/c小鼠设为对照组。 ⑵24周龄雌性MRL/lpr小鼠随机分为：狼疮组(MRL/lprgroup)，circRTN4腺相关病毒尾静脉注射组(MRL/lpr+circRTN4-Vgroup)，腺相关病毒对照组(MRL/lpr+circNC-Vgroup)，每组3只，同周龄雌性MRL/MPJ小鼠设为对照组。 CircRTN4腺相关病毒组和病毒对照组小鼠进行尾静脉注射腺相关病毒，6周后留取血液、收集24小时尿液标本后处死小鼠，留取双侧肾脏组织。RNAFISH及real-timePCR观察小鼠外周血单核细胞及血清外泌体中circRTN4沉默效果；生化试剂盒检测小鼠尿蛋白、BUN及Scr水平；HE、PAS及天狼猩红染色进行病理形态学观察；real-timePCR、westernblot、IF或IHC方法检测小鼠肾皮质FN和CyclinD1mRNA及蛋白的表达水平。 结果： 1.CircRTN4重组腺相关病毒有效下调狼疮鼠外周血单核细胞及血清外泌体中circRTN4的表达： ⑴RNAFISH结果显示，circRTN4阳性信号主要定位于细胞浆。与BALB/c和MRL/MPJ组小鼠相比，BALB/c+P和MRL/lpr组小鼠单核细胞中circRTN4表达水平明显增加；而尾静脉感染circRTN4重组腺相关病毒组小鼠单核细胞中circRTN4表达水平明显降低。 ⑵Real-timePCR结果显示，与BALB/c和MRL/MPJ组小鼠相比，BALB/c+P和MRL/lpr组小鼠血清外泌体中circRTN4表达水平明显增加；而BALB/c+P+circRTN4-V和MRL/lpr+circRTN4-V组小鼠血清外泌体中circRTN4表达水平降低。 2.敲低单核细胞circRTN4表达改善狼疮鼠蛋白尿水平： ⑴与BALB/c小鼠相比，BALB/c+P组小鼠24h蛋白尿水平，血肌酐及血尿素氮水平明显增加；敲低circRTN4后小鼠24h蛋白尿及血尿素氮水平降低，血肌酐水平无明显差异。 ⑵与MRL/MPJ组小鼠相比，MRL/lpr组小鼠24h蛋白尿水平，血肌酐及血尿素氮水平明显增加；敲低circRTN4后小鼠24h蛋白尿水平显著降低，血肌酐及血尿素氮水平无明显差异。 3.敲低单核细胞circRTN4表达改善狼疮鼠肾脏病理变化： HE染色显示，与BALB/c组小鼠相比，BALB/c+P小鼠肾小球体积增大，细胞数增多；而BALB/c+P+circRTN4-V组小鼠肾小球体积增大和细胞数目增多有所改善。PAS与天狼猩红染色显示，与BALB/c小鼠相比，BALB/c+P组小鼠肾小球系膜区明显增宽，胶原成分增多；而BALB/c+P+circRTN4-V组小鼠肾小球系膜区增宽水平降低，胶原成分减少。此外，在MRL/lpr小鼠中观察到类似结果。 4.敲低单核细胞circRTN4表达改善狼疮鼠肾小球细胞增殖： Westernblot和IHC结果显示，CyclinD1蛋白的阳性信号主要定位于细胞核中。与BALB/c和MRL/MPJ组小鼠相比，BALB/c+P和MRL/lpr组小鼠肾皮质CyclinD1蛋白表达明显增加；敲低单核细胞circRTN4后，小鼠肾皮质CyclinD1蛋白表达明显降低。 5.敲低单核细胞circRTN4改善狼疮鼠肾小球ECM沉积： Real-timePCR和IF结果显示，FN蛋白的阳性信号主要定位于细胞胞浆中。与MRL/MPJ和BALB/c组小鼠相比，MRL/lpr和BALB/c+P组小鼠肾皮质FNmRNA和蛋白表达水平明显增加；敲低单核细胞circRTN4后，小鼠肾皮质FN表达水平明显降低。 结论： 敲低BALB/c+P和MRL/lpr小鼠单核细胞中circRTN4，肾组织CyclinD1和FN蛋白表达降低，减轻肾小球细胞增殖和ECM沉积并改善肾损伤。
狼疮性肾炎;细胞外基质沉积;单核细胞外泌体;circRTN4;miR-513a-5p
河北医科大学
博士
病理学与病理生理学
刘淑霞;封晓娟
2022
中文
R593.242
2022-12-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）