卡介苗菌体裂解液逆转巨噬细胞RAW 264.7内毒素耐受及机制初探
目的：通过构建细胞内毒素耐受模型，评估内毒素耐受巨噬细胞RAW264.7相关基因表达变化，检测BCG菌体裂解液对内毒素耐受的影响并初步探讨其作用机制，以期为脓毒症患者的治疗提供有价值的参考。 方法：1.采用小鼠巨噬细胞RAW264.7，分为以下7组，即M+M对照组：先用完全DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium,杜尔贝科改良伊格尔培养基)培养20h，再用完全DMEM培养3h；M+L内毒素刺激组：先用完全DMEM培养20h,再用100ng/ml LPS刺激细胞3h；L+M对照组：先用10ng/ml LPS培养细胞20h，再用完全DMEM培养3h；L+L内毒素耐受组：先用10ng/ml LPS培养细胞20h，再用100ng/ml LPS刺激细胞3h；L+5B+M对照组：先用10ng/ml LPS培养细胞20h，随后提前15min加入蛋白终浓度为5μg/ml BCG菌体裂解液，再用完全DMEM培养3h；L+5B+L和L+20B+L BCG处理组：先用10ng/ml LPS培养细胞20h，在第二次LPS刺激前15min，分别加入蛋白终浓度为5μg/ml及20μg/ml BCG菌体裂解液，随后用100ng/ml LPS刺激细胞3h。各组在第一次20h培养后，细胞均用DMEM洗3遍，再进行随后处理。 2.提取各组细胞RNA，通过实时荧光定量PCR检测炎症细胞因子TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α,肿瘤坏死因子-α)和IL-1β(Interleukin-1β,白介素-1β)、脂滴相关蛋白ADRP(Adipose Differentiation Related Protein,脂肪分化相关蛋白)、抗菌肽CAMP(Cathelicidin Antimicrobial Peptide,Cathelicidin抗菌肽)、I型干扰素IFN-β(Interferon-β,β-干扰素)以及抗病毒蛋白Viperin(Virus Inhibitory Protein,病毒抑制蛋白)的mRNA表达水平变化。 3.提取各组细胞总蛋白，通过蛋白质印迹检测Viperin和蛋白质磷酸酶CN(calcineurin,钙调神经磷酸酶)蛋白表达水平变化。 4.通过油红O染色检测细胞LD(Lipid Droplet,脂滴)含量变化。 结果：1.与对照组(M+M)相比，刺激组(M+L)炎症细胞因子TNF-α(18.32±1.06vs.1.00，p＜0.01)和IL-1β(10945.00±2037.00vs.1.00，p＜0.01)mRNA表达显著增高；与刺激组(M+L)相比，内毒素耐受组(L+L)TNF-α(2.68±0.27vs.18.32±1.06，p＜0.01)和IL-1β(2081.00±462.80vs.10945.00±2037.00，p＜0.05)mRNA表达显著降低；5μg/ml BCG处理组(L+5B+L)TNF-α(3.59±0.26vs.2.68±0.27，p＜0.05)和IL-1β(4506.00±924.30vs.2081.00±462.80，p＜0.05)mRNA表达比耐受组显著提高；20μg/ml BCG处理组(L+20B+L)TNF-α(6.70±1.23vs.2.68±0.27，p＜0.05)和IL-1β(6089.00±555.80vs.2081.00±462.80，p＜0.01)mRNA表达比耐受组进一步显著提高。 2.与对照组(M+M)相比，刺激组(M+L)LD含量(1.26±0.06vs.1.00，p＜0.05)及ADRP(1.66±0.22vs.1.00，p＜0.05)mRNA表达显著增加；与刺激组(M+L)相比，内毒素耐受组(L+L)LD含量(3.85±0.48vs.1.26±0.06，p＜0.05)及ADRP(5.67±0.78vs.1.66±0.22，p＜0.01)mRNA表达进一步显著增加；5μg/ml BCG处理组(L+5B+L)LD含量(4.21±0.71vs.3.85±0.48，p＞0.05)及ADRP(5.28±1.07vs.5.67±0.78，p＞0.05)mRNA表达与耐受组无统计学差异；20μg/ml BCG处理组(L+20B+L)LD含量(3.41±0.35vs.3.85±0.48，p＞0.05)及ADRP(4.97±0.73vs.5.67±0.78，p＞0.05)mRNA表达也与耐受组无统计学差异。 3.与对照组(M+M)相比，刺激组(M+L)CAMP(51.18±5.94vs.1.00，p＜0.01)mRNA表达显著增高；与刺激组(M+L)相比，内毒素耐受组(L+L)CAMP(27.00±4.60vs.51.18±5.94，p＜0.01)mRNA表达显著降低；5μg/ml BCG处理组(L+5B+L)CAMP(52.68±9.61vs.27.00±4.60，p＜0.05)mRNA表达比耐受组显著提高；20μg/ml BCG处理组(L+20B+L)CAMP(71.90±10.99vs.27.00±4.60，p＜0.01)mRNA表达比耐受组进一步显著提高。 4.与对照组(M+M)相比，刺激组(M+L)IFN-β(956.60±40.60vs.1.00，p＜0.01)和Viperin(351.60±52.31vs.1.00，p＜0.01)mRNA表达显著增高；与刺激组(M+L)相比，内毒素耐受组(L+L)IFN-β(22.64±2.94vs.956.60±40.60，p＜0.01)和Viperin(98.75±4.11vs.351.60±52.31，p＜0.01)mRNA表达显著降低；5μg/ml BCG处理组(L+5B+L)IFN-β(26.80±4.91vs.22.64±2.94，p＞0.05)mRNA表达与耐受组无统计学差异，Viperin(143.50±15.06vs.98.75±4.11，p＜0.05)mRNA表达比耐受组显著提高；20μg/ml BCG处理组(L+20B+L)IFN-β(57.86±10.63vs.22.64±2.94，p＜0.05)和Viperin(210.10±13.30vs.98.75±4.11，p＜0.01)mRNA表达比耐受组显著提高。此外，与对照组(M+M)相比，刺激组(M+L)Viperin(2.26±0.23vs.0.00，p＜0.01)蛋白表达显著增高；与刺激组(M+L)相比，内毒素耐受组(L+L)Viperin(1.40±0.10vs.2.26±0.23，p＜0.05)蛋白表达显著降低；5μg/ml BCG处理组(L+5B+L)Viperin(2.00±0.17vs.1.40±0.10，p＜0.05)蛋白表达比耐受组显著提高；20μg/ml BCG处理组(L+20B+L)Viperin(1.89±0.04vs.1.40±0.10，p＜0.01)蛋白表达也比耐受组显著提高。 5.与对照组(M+M)相比，刺激组(M+L)CN(0.99±0.05vs.1.00，p＞0.05)蛋白表达水平无统计学差异；与刺激组(M+L)相比，内毒素耐受组(L+L)CN(0.57±0.07vs.0.99±0.05，p＜0.01)蛋白表达水平显著降低；5μg/ml BCG处理组(L+5B+L)CN(0.62±0.06vs.0.57±0.07，p＞0.05)蛋白表达水平与耐受组无统计学差异；20μg/ml BCG处理组(L+20B+L)CN(0.62±0.06vs.0.57±0.07，p＞0.05)蛋白表达水平也与耐受组无统计学差异。 结论：1.LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7，TNF-α、IL-1β、ADRP、CAMP、IFN-β以及Viperin mRNA表达水平增加；LD含量增加。 2.RAW264.7细胞内毒素耐受后，LPS再刺激，TNF-α、IL-1β、CAMP、IFN-β以及Viperin mRNA表达水平降低；LD含量及ADRP mRNA表达水平增加。 3.BCG菌体裂解液可以逆转RAW264.7细胞内毒素耐受，提高耐受细胞TNF-α、IL-1β、CAMP、IFN-β以及Viperin mRNA表达水平，但不影响LD含量及ADRP mRNA表达水平。 4.内毒素耐受RAW264.7细胞Viperin蛋白表达水平降低，BCG菌体裂解液可以逆转内毒素耐受，提高耐受细胞Viperin蛋白表达水平。 5.内毒素耐受RAW264.7细胞CN蛋白表达水平降低，BCG菌体裂解液逆转内毒素耐受而没有提高CN蛋白表达水平。
脓毒症;卡介苗菌体裂解液;巨噬细胞;内毒素;耐受机制
大连医科大学
硕士
微生物学
孙文长
2022
中文
R631.2;R982
2022-12-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）