TRPV1配体辣椒素调节脂肪源性间充质干细胞的增殖和衰老
目的： 脂肪源性间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs）由于来源丰富、取材简单、免疫原性和成肿瘤性低，是再生医学和组织工程研究中干细胞疗法的重要种子细胞，但其在高糖环境或者体外扩增过程中容易出现衰老及增殖能力下降，严重影响ADSCs的治疗效果，限制了ADSCs细胞治疗在糖尿病患者中的应用。有研究发现，大鼠和人的ADSCs均表达瞬时受体电位香草酸亚型1（Transient receptor potential vanilloid1，TRPV1），但其生理学功能尚未阐明。因此，本研究旨在观察TRPV1配体辣椒素对二维（Two dimensional culture,2D）和三维（Three dimensional culture,3D）培养下ADSCs增殖的影响以及对高糖诱导的ADSCs衰老是否有保护作用，由此改良体外培养方法为临床获得足够数量且高质量的ADSCs提供保障。 方法： （1）原代培养大鼠脂肪干细胞，流式细胞术对ADSCs进行免疫表型（阳性指标CD29、CD90和阴性指标CD31、CD45）鉴定后，取3~5代进行实验，分别采用2D培养和3D培养模式，后者采用琼脂糖微孔板法培养3D细胞球，观察不同浓度辣椒素（1μM，3μM，10μM）对两种维度培养下ADSCs增殖的影响。2D培养的增殖指标采用CCK-8检测细胞活力，流式细胞术检测细胞周期，Western blot检测增殖细胞核抗原PCNA的蛋白水平。3D培养下ADSCs的增殖采用Celltiter-Glo3D Cell Viability Assay检测细胞活力。采用Western blot检测2D和3D状态下的细胞多能转录因子Nanog、Oct4、Sox2的水平，确定ADSCs的干性。Western blot检测细胞周期抑制蛋白P21的表达以及ERK的磷酸化水平，给予MAPK/ERK信号通路阻断剂PD98059确定该通路对ADSCs增殖的作用。慢病毒转染shRNA敲低TRPV1表达进一步探究TRPV1对ADSCs增殖的影响。 （2）取第3~5代的ADSCs，用高糖（33mM葡萄糖）培养基孵育ADSCs4天，建立高糖诱导的干细胞衰老损伤模型，给予不同浓度的辣椒素（1μM，3μM，10μM）处理细胞，通过CCK-8检测细胞活力，β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞，流式细胞术检测细胞周期阻滞、活性氧（ROS）水平及细胞凋亡，Western blot检测SIRT1和P21，Elisa检测炎症因子IL-6水平，确定辣椒素对高糖诱导的ADSCs衰老的影响。TRPV1-shRNA慢病毒转染细胞，进一步确定沉默TRPV1后是否影响辣椒素抗ADSCs衰老作用。 结果： （1）辣椒素显著促进2D培养的ADSCs增殖，表现为显著增加细胞活力，上调增殖细胞核抗原PCNA的蛋白水平，其中3μM辣椒素的作用最为显著，并增加细胞周期中S期和G2/M期的比例。 （2）与2D培养相比，3D培养下ADSCs细胞球的多能干性指标Nanog、Oct4、Sox2表达水平更高，但3D培养状态下的细胞增殖能力远低于2D。3μM辣椒素促进3D培养的ADSCs增殖，Celltiter-Glo3D Cell Viability Assay结果确定辣椒素水平显著增加3D状态下细胞活力，且Western blot结果显示辣椒素并不会降低3D状态下ADSCs中Nanog、Oct4、Sox2干性基因表达。 （3）Western blot结果显示，辣椒素剂量依赖性增加ERK的磷酸化水平，并显著下调细胞周期抑制蛋白P21的表达。而预先给予MAPK/ERK信号通路阻断剂PD98059，不仅取消辣椒素的促增殖作用，还降低细胞活力。 （4）Western blot和qPCR结果确定TRPV1-shRNA显著下调TRPV1的表达，而TRPV1敲减抑制PCNA水平，降低2D和3D培养状态下的细胞活力，并取消了辣椒素的促增殖效应。进一步研究发现，3μM辣椒素可上调TRPV1的表达水平。 （5）辣椒素显著抑制高糖诱导的ADSCs衰老，表现为减少高糖诱导的细胞衰老数目，解除G1/G0期抑制，降低高糖诱导的ROS生成，并降低IL-6水平。Western blot结果显示，辣椒素可上调长寿蛋白SIRT1表达，下调衰老蛋白P21表达，而SIRT1抑制剂EX527取消了辣椒素的抑制ADSCs衰老效应。此外，流式检测还证实辣椒素可降低高糖诱导的细胞凋亡率。 （6）β-半乳糖苷酶染色和CCK-8结果显示，TRPV1-shRNA可增加高糖状态下的细胞衰老，并且取消辣椒素抑制衰老的效应。 结论： （1）辣椒素对2D和3D培养的ADSCs均有显著促增殖效应，其机制可能与激活MAPK/ERK信号通路，下调细胞周期抑制蛋白P21水平有关。 （2）辣椒素可抑制高糖诱导的ADSCs衰老和凋亡，其机制可能与上调长寿蛋白SIRT1的表达，下调细胞衰老相关蛋白P21的表达，减少高糖诱导的ROS和IL-6生成有关。
生物医学工程;脂肪源性间充质干细胞;细胞增殖;细胞衰老;瞬时受体电位香草酸亚型1;辣椒素
南昌大学医学部
硕士
基础医学
罗丹
2022
中文
R318
2022-11-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）