基于Kaiso/β-catenin信号通路探究铅暴露影响学习记忆的机制
目的： 铅是一种重金属污染物，它严重影响公共环境卫生安全。铅暴露可以损伤多个系统。其中，神经系统是铅发挥毒性作用的主要部位。铅暴露可能导致神经发育迟缓、学习记忆障碍、智力低下等，并且铅的神经毒性作用可能持续存在并影响后代。铅暴露改变树突棘的生长影响学习记忆，是铅发挥神经毒性作用的机制之一。大量研究表明，β-连环蛋白（β-catenin）与树突棘的生长密切相关。转录因子Kaiso通过结合β-catenin的启动子区域抑制β-catenin的转录。然而，铅暴露是否影响Kaiso和β-catenin的表达尚不清楚。因此本课题首先构建铅暴露大鼠模型，研究在铅暴露的条件下Kaiso和β-catenin的表达变化。其次，采用肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞构建细胞铅暴露模型，探讨在PC12细胞中，铅暴露对Kaiso和β-catenin表达的影响。最后，我们在PC12细胞铅暴露模型中沉默Kaiso的表达，探究铅暴露条件下Kaiso是否影响β-catenin的转录。本课题研究铅的神经毒性机制，为进一步治疗和预防铅中毒提供理论依据。 实验方法： 1、铅暴露SD大鼠学习记忆能力的检测 12周龄性成熟SD大鼠，雌鼠：雄鼠以2：1合笼。用阴道涂片法确定雌鼠受精后，将雌鼠随机分3组：空白对照组、低剂量铅暴露组和高剂量铅暴露组，给怀孕的雌鼠分别饮用浓度为0、0.5g/L和2.0g/L的醋酸铅溶液，时间从受精开始到雌鼠分娩结束后21天仔鼠断乳。所有动物实验对象均为断乳仔鼠。Morris水迷宫实验检测各组仔鼠的学习记忆能力。 2、铅暴露SD大鼠血铅和海马组织铅含量的测定 电感耦合等离子体原子发射光谱法（InductivelyCoupledPlasma-AtomicEmissionSpectroscopy，ICP-AES）测定空白对照组、低剂量铅暴露组和高剂量铅暴露组中仔鼠全血和海马组织中的铅含量。 3、铅暴露SD大鼠海马组织和铅暴露PC12细胞中Kaiso表达的变化 采用实时荧光定量PCR（Real-timeQuantitativePolymeraseChainReaction，qPCR）、蛋白印迹技术（Westernblotting，WB）和免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）技术检测各组铅暴露SD大鼠海马组织和铅暴露PC12细胞中Kaiso表达的变化。培养PC12细胞，分别给予浓度为0μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM的醋酸铅溶液，建立铅暴露细胞模型，采用qPCR、WB和免疫细胞化学（Immunocytochemistry，ICC）实验技术，检测铅暴露PC12细胞Kaiso表达的变化。 4、铅暴露SD大鼠海马组织和铅暴露PC12细胞中β-catenin表达的变化 采用qPCR、WB和IHC技术检测各组铅暴露SD大鼠海马组织和铅暴露PC12细胞中β-catenin表达的变化。 5、铅暴露PC12细胞模型中沉默Kaiso后β-catenin表达的变化 培养铅暴露PC12细胞，采用染色质免疫共沉淀技术检测Kaiso与β-catenin启动子的结合情况，采用荧光素酶报告基因实验检测在100μM醋酸铅浓度下沉默Kaiso对β-catenin启动子活性的影响。采用qPCR、WB和ICC技术检测空白对照组、100μM醋酸铅+转染NCsiRNA（阴性对照）组和100μM醋酸铅+转染KaisosiRNA组中β-catenin的mRNA和蛋白表达的变化。 实验结果： 1、铅暴露SD大鼠的学习记忆能力降低 Morris水迷宫检测结果显示，铅暴露组大鼠的逃避潜伏期较空白组更长，存在显著性差异（P＜0.05）。空间搜索实验结果表明铅暴露组大鼠在规定时间内找到平台的时间较空白组长，穿越平台的次数显著减少（P＜0.05），并且铅浓度越高，大鼠穿过平台的次数越少。 2、铅暴露SD大鼠的血铅浓度和海马组织铅浓度升高 ICP-AES检测结果显示，空白对照组中未检测出铅含量，铅暴露组SD大鼠的血铅浓度和海马组织铅浓度升高，存在一定的剂量依赖关系（P＜0.05）。 3、铅暴露SD大鼠海马组织和铅暴露PC12细胞模型中Kaiso表达升高 qPCR和WB实验结果显示，在大鼠海马组织和PC12细胞中KaisomRNA和蛋白表达水平均随着铅浓度的升高而增加，存在一定的剂量依赖关系。IHC结果发现，在海马组织CA1、CA3和DG区Kaiso的免疫反应性随着铅浓度的增加而增强。ICC结果表明，在铅暴露PC12细胞中Kaiso的免疫反应性随着铅浓度的增加而不断增加，并且存在一定的剂量依赖关系。 4、铅暴露SD大鼠海马组织和铅暴露PC12细胞模型中β-catenin表达降低 qPCR和WB实验结果显示，在铅暴露大鼠海马组织和PC12细胞中β-cateninmRNA和蛋白表达水平随着铅浓度的升高而不断下降，存在一定的剂量依赖关系。IHC结果发现，在海马组织CA1、CA3和DG区β-catenin的免疫反应性随着铅浓度的增加而下降。ICC结果表明，在PC12细胞中β-catenin的免疫反应性随着铅浓度的增加逐渐减弱。 5、铅暴露PC12细胞中沉默Kaiso后β-catenin的表达增加 铅暴露PC12细胞中Kaiso可以直接结合β-catenin的启动子。铅暴露PC12细胞中沉默Kaiso后β-catenin启动子荧光素酶活性明显增加（P＜0.05）。沉默Kaiso后，qPCR、WB和ICC实验结果显示在PC12细胞中β-catenin表达水平明显升高（P＜0.05）。 结论： 铅暴露通过上调转录因子Kaiso的表达水平抑制β-catenin的转录，导致β-cateninmRNA和蛋白表达水平下降，可能减少神经元树突棘的密度从而影响学习记忆。这为进一步阐明铅暴露对学习记忆的影响机制和为治疗铅暴露导致的神经系统损伤提供了新的研究思路。
铅暴露;学习记忆;Kaiso/β-catenin信号通路;分子机制
南昌大学医学部
硕士
基础医学
祝高春
2022
中文
R114
2022-11-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）