TLR4基因敲除通过慢性低度炎症介导老年小鼠自发性肥胖
目的： 探索TLR4（Toll like receptor4,TLR4)基因敲除对老年小鼠肥胖的影响及其相关机制。 方法： 将60只雄性野生型小鼠（wild type,WT；C57BL/10ScN）与60只雄性TLR4基因敲除(TLR4knockout,TLR4-/-;C57BL/10ScN background)小鼠按照年龄分为青年（6月龄）小鼠；中年（12月龄）小鼠；老年（18月龄）小鼠。每个年龄段分为2组：野生型组（WT组）和TLR4基因敲除型组（TLR4-/-组）,每组20只小鼠。所有小鼠出生后21天断奶，标准饲料饲喂养。 1、研究TLR4基因敲除对小鼠体重的影响：在6月龄、12月龄和18月龄记录小鼠体重、体长，称量小鼠皮下脂肪、肾周脂肪的重量，计算皮下脂肪指数、肾周脂肪指数和Lee`s index(反应小鼠肥胖程度)；HE染色观察脂肪和肝脏组织结构变化;油红O染色观察肝脏脂肪积累情况。 2、研究TLR4基因敲除对老年小鼠脂类代谢的影响：实时荧光定量PCR检测肝脏和脂肪组织中中糖脂代谢基因Leptin、脂联素(Adiponectin,Adipoq)、Srebp1c、碳水化合物反应元件结合蛋白（Carbohydrate-responsive element-binding protein，ChREBP）的mRNA表达情况；Western blot检测肝脏中Adipoq、ChREBP蛋白的表达情况。 3、研究TLR4基因敲除对老年小鼠肝脏中炎症的影响：实时荧光定量PCR检测肝脏炎症因子IL-1β、IL6、IL10mRNA和M1(M1type macrophage,M1)型巨噬细胞marker基因CD86，M2(M2type macrophage,M2)型巨噬细胞marker基因CD163的mRNA表达情况；免疫组化检测肝脏中CD86、CD163的免疫反应性。 4、研究TLR4基因敲除对老年小鼠肝脏中MyD88和TRIF信号通路的影响：实时荧光定量PCR检测肝脏中TLR4相关通路基因S100A8、S100A9、髓样分化因子88(Myeloid differentiation primary response protein88,MyD88)、干扰素TIR结构域衔接蛋白（Toll/IL-1receptor domain-containing adaptor,TRIF）、干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor3,IRF3)mRNA表达情况；Western blot检测肝脏中TRIF、pIRF3蛋白的表达情况；免疫组化检测肝脏中TRIF、pIRF3蛋白表达情况。 5、研究TLR4基因敲除对老年小鼠脾脏中辅助T（T helper,Th）细胞分化的影响：在6月龄、12月龄和18月龄时称量小鼠的脾脏重量，计算脾脏指数；实时荧光定量PCR检测脾脏中Tbet、Gata3、Rorγt、Foxp3、IL2、IL4、IL17a、IL10mRNA的表达情况；Western blot检测Tbet、Gata结合蛋白3(GATA binding protein3,GATA3)、维甲酸相关核孤儿受体γt(Retinoid-related orphan receptor-γt,Rorγt)、Foxp3蛋白的表达情况；免疫组化检测脾脏中Tbet、Gata3、IL17a、Foxp3蛋白的表达情况。 6、研究TLR4基因敲除对老年小鼠血清中炎症因子和Leptin分泌的影响：ELISA检测18月龄WT和TLR4-/-小鼠血清中IL1β、IL6、IL10和Leptin的蛋白表达情况。 结果： 1、6月龄、12月龄和18月龄TLR4-/-小鼠体重增加；但是6月龄TLR4-/-小鼠皮下脂肪和肾周脂肪指数下降；12月龄和18月龄TLR4-/-小鼠皮下脂肪和肾周脂肪指数升高了；12月龄TLR4-/-小鼠Lee''s index没有变化，但18月龄TLR4-/-小鼠Lee`s index升高；HE染色结果显示老年TLR4-/-小鼠肝脏中展现出更多的空泡样结构，皮下脂肪和肾周组织直径增大；油红O染色显示老年TLR4-/-小鼠肝脏展现出更多的脂肪蓄积。 2、18月龄TLR4-/-小鼠肝脏中致脂基因ChREBP的mRNA表达升高，同时脂肪因子Adipoq的mRNA表达下降；18月龄TLR4-/-小鼠肾周脂肪和皮下脂肪组织中ChREBP、Leptin的mRNA表达升高，同时Adipoq的mRNA表达下降；18月龄TLR4-/-小鼠中ChREBP蛋白表达升高，同时Adipoq蛋白表达下降。 3、18月龄TLR4-/-小鼠肝脏中IL1β、CD86的mRNA表达升高，IL10、CD163的mRNA表达下降；18月龄TLR4-/-小鼠增加了肝脏中CD86阳性的巨噬细胞数量，同时减少了CD163阳性的巨噬细胞数量。 4、18月龄TLR4-/-小鼠肝脏中TRIF的mRNA表达增加，TRIF和pIRF3蛋白表达增加；同时18月龄TLR4-/-小鼠肝脏中增强了pIRF3的免疫反应性。但是18月龄TLR4-/-小鼠肝脏中S100A8、S100A9、MyD88mRNA表达并没有改变。 5、18月龄TLR4-/-小鼠脾脏组织中Tbet、Rorγt、IL2、IL17a的mRNA表达升高，GATA3、Foxp3、IL4的mRNA表达下降；18月龄TLR4-/-小鼠脾脏中Tbet、Rorγt蛋白表达水平升高，Gata3、Foxp3蛋白表达水平下降；同时，18月龄TLR4-/-小鼠脾脏中增强了Tbet、IL17a蛋白的免疫反应性，减弱了Gata3、Foxp3蛋白的免疫反应性；18月龄TLR4-/-小鼠血清中炎症因子IL6和Leptin蛋白表达升高。 结论： 1、TLR4基因敲除能诱发老年小鼠自发性肥胖。 2、TLR4基因敲除增加了致脂基因ChREBP的表达并且影响了老年小鼠肝脏和脂肪组织中脂类代谢。 3、TLR4基因敲除诱发了老年小鼠肝脏炎症，其可能机制为通过激活TRIF信号转导通路从而促进了抗炎型巨噬细胞M2向致炎型巨噬细胞M1极化 4、TLR4基因敲除增大老年小鼠的脾脏指数并通过打破了脾脏中Th1/Th2和Th17/Treg细胞的平衡产生了慢性低度的炎症。
自发性肥胖;老年患者;病理机制;TLR4基因;慢性低度炎症
南昌大学医学部
硕士
基础医学
陈红平
2022
中文
R589.202.325
2022-11-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）