基于肠-肝轴研究决明子乙醇提取物改善非酒精性脂肪性肝病的作用及机制
本文主要从以下几个部分展开论述： 第一章 网络药理学预测研究决明子治疗NAFLD的作用机制 目的： 构建决明子与疾病治疗靶点间的相互作用网络，预测决明子治疗非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的潜在靶点和机制。 方法： 1.决明子活性成分及靶点挖掘：中药系统药理学数据库与分析平台、PubChem、Swiss Target Prediction、Pharm Mapper数据库检索决明子活性成分和靶点。 2.NAFLD相关靶点挖掘：Gene Cards、OMIM、药物靶标数据库（TTD）和Drug Bank数据库挖掘NAFLD靶点。 3.蛋白质相互作用网络（PPI）构建：R语言编程筛选决明子和NAFLD靶点交集，并将交集靶点导入String数据库构建PPI网络。 4.PPI网络拓扑分析：利用Cytoscape3.7.2软件计算度值、介度中心度和接近中心度等重要参数，筛选出核心靶点。 结果： 1.共收集到决明子有效活性成分14个，主要为蒽醌类和苯并吡喃酮类；共检索到决明子作用靶点481个。合并疾病数据库靶点后，共挖掘到NAFLD靶点426个。R语言编程选取决明子与NAFLD靶点交集，获得76个交集靶点。 2.PPI网络拓扑分析表明，该网络共有76个节点，154条边，节点度的均值为4.05，度值较高的靶点包括Toll样受体4（TLR4）、肿瘤坏死因子（TNF）、闭合蛋白（OCLN）、紧密连接蛋白-1（TJP1），白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）。 3.GO功能注释结果显示，分子功能（MF）主要涉及类固醇激素受体活性、蛋白酶结合、胰岛素受体底物结合等；细胞成分（CC）主要包括胞液、细胞外间隙、蛋白复合物等；生物过程（BP）主要包括细胞对脂多糖（LPS）的反应、细胞对胰岛素刺激的反应和凋亡程序的负调控等。 结论： 决明子蒽醌类和苯并吡喃酮类活性成分可能通过干预LPS介导的慢性炎症，调节TLR、TNF、Occludin、TJP1等靶点和信号通路的转录表达，初步预测决明子可能影响炎症反应、肠道紧密连接和糖脂代谢等病理生理过程。 第二章 决明子橙黄决明素改善胆汁酸肠肝循环治疗NAFLD小鼠 目的： 评估决明子橙黄决明素（AO）对NAFLD小鼠的治疗作用，并探讨该作用与胆汁酸肠肝循环的相关性。 方法： 1.48只体重24-28g的雄性昆明系小鼠随机分为对照组（CON）；高脂饮食组（HFD）；AO1.5g/kg/d组；AO3g/kg/d组；AO5g/kg/d组；AO8g/kg/d组，每组8只。CON组给予正常饮食，其余各组喂养高脂饮食（HFD）12周，建立NAFLD模型。成功建立模型后，CON组和HFD组给予生理盐水灌胃，各用药组给予相应剂量的AO灌胃，给药4周后处死，取材并记录肝脏指数，在造模及给药期间每周记录一次体重。 2.按试剂盒说明应用酶标仪检测肝脏胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和血清总胆汁酸（TBA）水平。 3.Hamp;E染色观察肝组织肝细胞脂肪变、肝小叶内炎症和肝细胞气球样变等病理变化情况。 4.q-PCR检测各组小鼠肝脏法尼醇X受体（FXR）、小分子异源二聚体（SHP）、成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）、胆固醇7A羟化酶（CYP7A1）、CYP7B1、CYP8B1，以及肠道FXR、纤维母细胞生长因子15（FGF15）mRNA表达。 结果： 1.与对照组相比，HFD小鼠体重和肝脏指数均显著升高；AO干预4周后，AO组小鼠体重和肝脏指数与HFD组相比显著降低。 2.与CON组相比，HFD组小鼠肝脏TC、TG和血清TBA水平显著升高；AO各剂量组小鼠肝脏TC、TG和血清TBA水平呈剂量依赖式下降。 3.对照组小鼠肝小叶结构完整，排列正常，肝细胞形态正常，未见脂滴和炎性细胞；HFD组小鼠有较多肝细胞脂肪变，存在大量的脂肪空泡和散在的炎性浸润；AO组小鼠肝细胞和肝小叶形态完整，仅见少量脂滴和炎性细胞。 4.与CON组小鼠相比，HFD组肝脏FXR、SHP、FGFR4的mRNA表达显著升高，回肠FXR、FGF15的mRNA表达同样显著升高；肝脏胆固醇限速酶CYP7A1、CYP7B1、CYP8B1的mRNA表达显著降低。AO治疗显著下调了肝脏FXR、SHP、FGFR4和回肠FXR、FGF15的mRNA表达，并显著上调肝脏CYP7A1、CYP7B1、CYP8B1的mRNA表达。 结论： 决明子AO治疗可显著改善小鼠NAFLD，其机制可能与AO介导FXR天然拮抗机制，调节胆汁酸肠肝循环有关。 第三章 决明子橙黄决明素对NAFLD小鼠肠道生物屏障的保护作用 目的： 探讨AO对NAFLD的治疗作用与肠道菌群丰度和多样性的相关性，评估AO对NAFLD小鼠肠道生物屏障的保护作用。 方法： 1.粪便样本收集：将小鼠粪便收集到无菌EP管后迅速浸入冰盒防止样本DNA降解，随后转移至﹣80℃冰箱保存。 2.DNA抽提和PCR扩增：按试剂盒说明书进行提取总DNA后紫外分光光度计测量DNA浓度和纯度，2%琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量检测，V3-V4可变区使用338F和806R引物进行PCR扩增。 3.Illumina Miseq测序：回收的PCR产物经纯化和洗脱后检测定量。根据Illumina MiSeq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE2*300的文库，利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序。 4.生物信息学分析参照“Atacama soil microbiome tutorial”流程完成。 结果： 1.粪便肠道微生物物种组成分析结果显示，拟杆菌门、厚壁菌门和变形杆菌门占门水平的主要组成部分；与CON组相比，HFD组小鼠Firmicutes丰度显著升高，Bacteroidetes丰度显著下降，AO干预可显著降低Firmicutes丰度，并显著升高Bacteroidetes丰度；HFD组Firmicutes/Bacteroidetes比值与CON小鼠相比显著升高，AO组Firmicutes/Bacteroidetes比值则较HFD组显著降低。 2.在属水平上，HFD组艾克曼菌丰度较CON组显著降低，AO干预可显著升高Akkermansia丰度，提示AO具有维持肠道黏液层完整性的功能，可降低肠道通透性调节肝脏免疫应答。与CON组相比，HFD组双歧杆菌丰度显著降低，AO干预可显著升高Bifidobacterium丰度，提示AO可促进肠道生物屏障形成，以减少肠源性内毒素的渗透。 2.粪便菌群?多样性指数分析显示，与CON组相比，HFD组Chao1、Faith''s PD、Observed OTUs和Shannon指数均显著降低；AO治疗组小鼠肠道微生物Chao1、Faith''s PD、Observed OTUs和Shannon指数较HFD组显著升高。 3.β多样性指数的主成分分析（PCA）和主坐标分析（PCoA）显示3组间样品的距离较远，提示组间物种组成结构差异较大。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）显示属于同一分组的样本彼此之间距离较近，同时不同分组的点之间距离较远，表明组间?多样性差异较大。 结论： 决明子AO可改善NAFLD小鼠肠道微生物多样性和丰度，并通过增加Akkermansia、Bifidobacterium菌属的丰度保护肠道生物屏障。 第四章 决明子橙黄决明素对NAFLD小鼠肠道机械屏障和免疫屏障的保护作用 目的： 探讨AO对NAFLD的治疗作用是否与修复肠道机械屏障，降低肠道通透性，从而减轻LPS诱导的肝脏炎症反应有关。 方法： 1.Hamp;E染色观察回肠上皮细胞间的紧密连接。 2.q-PCR和蛋白印迹法检测各组小鼠回肠紧密连接分子Occludin和闭锁小带蛋白1（ZO-1）的mRNA和蛋白表达水平。 3.酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组小鼠血浆脂多糖（LPS）水平和肝组织匀浆中炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平。 结果： 1.CON组小鼠肠道粘膜各层结构未见明显缺损，绒毛排列有序，上皮细胞形态呈高柱状；HFD组小鼠回肠组织绒毛萎缩，缺损断裂，上皮细胞紧密连接间隙增宽，黏膜上皮细胞坏死脱落，上皮层与固有层分离；AO组小鼠回肠绒毛形态好转，缺损程度较轻，肠黏膜上皮完整、形态正常。 2.与CON组相比，HFD组小鼠回肠紧密连接分子Occludin、ZO-1mRNA和蛋白表达显著降低；AO组小鼠回肠Occludin、ZO-1的mRNA和蛋白表达较HFD组显著增加，表明AO可修复上皮细胞间的紧密连接，保护肠道机械屏障，降低肠道通透性。 3.HFD小鼠血浆LPS和肝组织TNF-α、IL-6、IL-1β水平较对照组显著升高，AO干预可显著降低小鼠血浆LPS和肝组织TNF-α、IL-6、IL-1?水平。 结论： 决明子AO可能通过修复上皮细胞间的紧密连接，减少肠源性LPS向门静脉易位，抑制LPS/TLR4/NF-κB通路，修复肝脏免疫屏障。
决明子;橙黄决明素;非酒精性脂肪性肝病;肠-肝轴;肠道屏障功能
南昌大学医学部
硕士
基础医学
杨树龙
2022
中文
R282.71;R285.5
2022-11-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）