LncPrep+96kb敲除对小鼠卵巢功能的影响及机制研究
目的： LncPrep+96kb是一种长链非编码RNA，在小鼠卵巢颗粒细胞中特异性表达，但其在卵巢中的功能尚不清楚。本课题通过构建LncPrep+96kb敲除小鼠探究其在卵巢中的功能及可能作用机制。 方法： 通过CRISPR/Cas9技术构建LncPrep+96kb敲除小鼠，通过生育力和超排卵检测LncPrep+96kb敲除雌鼠的生育力和排卵情况； 通过RNA-sequence筛选差异表达基因，我们识别了INHBB；通过实时荧光定量PCR验证RNA-sequence数据；INHBB是抑制素B的组成亚基，通过Elisa检测敲除型和野生型雌鼠血清和颗粒细胞上清液中抑制素B表达量，颗粒细胞过表达LncPrep+96kb后细胞上清液中抑制素B表达量，正反两面验证LncPrep+96kb对抑制素B表达的影响； EDF1是细胞内重要的转录因子，我们前期报道了EDF1通过与LncPrep+96kb相互作用介导了颗粒细胞雌激素合成的调控。我们通过实时荧光定量PCR和蛋白印迹检测了LncPrep+96kb敲除小鼠EDF1表达变化。培养原代颗粒细胞，转染过表达EDF1和干扰EDF1质粒，观察EDF1对抑制素B的表达影响； 通过天狼星红染色观察LncPrep+96kb敲除型雌鼠卵巢组织纤维化的变化，POP是LncPrep+96kb的靶基因，研究发现其异常表达与多个组织器官的纤维化有关，通过实时荧光定量PCR和蛋白印迹检测了POP表达变化，培养原代颗粒细胞，转染过表达POP质粒，通过实时荧光定量PCR和蛋白印迹检测了纤维化因子TGF-β1、MMP2、PPAR-γ等的表达变化。 结果： 生育力检测发现LncPrep+96kb敲除型雌鼠在6个月期间产仔数量（纯合子：20.333±1.528；野生型：26.333±4.509）和每次产仔数量明显低于对照组野生型雌鼠（纯合子：3.856±0.629；野生型：5.133±1.102）；超排实验发现LncPrep+96kb敲除型雌鼠排出的卵子比野生型雌鼠排出的卵子数量少（纯合子：22.33±12.503；野生型：41.000±21.656）。 通过RNA-sequence筛选差异表达基因，用实时荧光定量PCR验证了LncPrep+96kb敲除小鼠中，INHBB明显增加。INHBB是抑制素B的组成亚基，我们通过Elisa检测了抑制素B的表达量，发现LncPrep+96kb敲除小鼠血清和LncPrep+96kb敲除颗粒细胞上清液抑制素B表达量较野生型小鼠明显增加。培养野生型颗粒细胞，过表达LncPrep+96kb后，抑制素B表达量下降。LncPrep+96kb敲除鼠卵巢中EDF1表达量减少。原代颗粒细胞过表达EDF1减少了抑制素B的合成，干扰EDF1表达促进了抑制素B的合成。FSH是颗粒细胞抑制素B的主要调节因子，我们发现FSH抑制了LncPrep+96kb表达，促进抑制素B的分泌。 天狼星红染色显示LncPrep+96kb敲除型较野生型小鼠卵巢纤维化明显。蛋白印迹结果显示卵巢纤维化相关指标TGF-β1明显增加，而MMP2和PPAR-γ水平降低。LncPrep+96kb敲除型较野生型小鼠卵巢POP表达明显减少，同时在原代颗粒细胞中过表达POP，抑制了TGF-β1表达，增加了MMP2和PPAR-γ的表达。 结论： LncPrep+96kb敲除小鼠的生殖力和排卵率降低； LncPrep+96kb抑制了颗粒细胞抑制素B的表达，EDF1可能介导了LncPrep+96kb对抑制素B的调控作用； LncPrep+96kb敲除小鼠卵巢纤维化增加，POP可能介导了卵巢的纤维化。
卵巢功能;长链非编码RNA;分子机制
南昌大学医学部
硕士
基础医学
王静
2022
中文
R339.22
2022-11-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）