P2Y13受体在HIV-1包膜糖蛋白gp120引起的颈部交感神经节病变中的作用及机理研究
目的：人类免疫缺陷病毒（HIV）感染已成为严重威胁人类健康的全球性问题，获得性免疫缺陷综合征（Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）相关并发症，如心血管疾病引起的死亡人数正在逐年增加，成为艾滋病患者死亡的重要威胁。HIV-1包膜糖蛋白gp120作为HIV的致病蛋白，可以产生与HIV相似的神经性病变。研究表明，HIV感染导致的心血管疾病与交感活性相关，且HIV感染的交感神经节中存在HIV抗原，但HIV-1包膜糖蛋白gp120对颈部交感神经节的作用及其分子机制并不清楚。研究发现，P2Y13受体参与糖尿病神经病理痛的发生及脂质诱导的胃肠神经元的数量变化及神经元的分化，涉及ADPβS诱导的心脏交感神经功能异常，这提示P2Y13受体可能是神经系统疾病的潜在治疗靶点。因此本文探讨P2Y13受体在gp120引起的颈部交感神经节病理变化中的作用及其分子机制，为HIV感染合并心脏自主神经病变及心血管功能异常的防治提供实验基础。 方法：动物实验方法：本研究应用HIV-1包膜糖蛋白gp120刺激颈交感神经建立大鼠交感神经损伤模型。实验动物随机分组：正常对照组（control group）；假手术对照组（sham group）；gp120处理组（gp120group）；gp120处理并P2Y13shRNA处理组（gp120+P2Y13shRNA group）；gp120处理并空载质粒处理组（gp120+NC shRNA group）。每组10只。实验内容：（1）采用间接尾袖法检测各组大鼠心率、血压，心电图记录分析心率变异性的变化情况；（2）记录各组大鼠心交感神经的放电情况；（3）实时定量PCR方法检测颈上神经节（Superior cervical ganglion，SCG）中P2Y13受体mRNA水平变化；（4）蛋白印迹方法检测SCG中P2Y13受体、NLRP3炎性小体、Caspase-1、GSDMD、炎性因子IL-1β、IL-18蛋白表达变化；（5）免疫荧光双标法检测各组大鼠SCG中P2Y13受体与神经元标记物（NeuN）的共表达情况。细胞实验方法：应用HIV-1包膜糖蛋白gp120培养PC12细胞建立细胞损伤模型。实验分组为：正常对照组（control group）；gp120处理组（gp120group）；gp120处理并P2Y13shRNA处理组（gp120+P2Y13shRNA group）；gp120处理并空载质粒处理组（gp120+NC shRNA group）。实验内容：（1）HIV-1gp120浓度筛选：通过CCK-8法检测各浓度gp120（0，0.2，0.4，0.8，1.6nmol/L）对细胞存活的影响，通过蛋白印迹法检测P2Y13受体蛋白的表达情况选定gp120最合适的建模浓度；（2）实时定量PCR方法检测各组PC12细胞中P2Y13受体mRNA的表达变化；（3）蛋白印迹方法检测各组PC12细胞中P2Y13受体、NLRP3炎性小体、Caspase-1、GSDMD、ASC、炎性因子IL-1β、IL-18蛋白表达水平变化；（4）酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,Elisa）方法检测PC12细胞培养上清液中炎性因子白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素18（IL-18）的释放量；（5）应用细胞内钙检测试剂盒（BestBio，中国上海），观察control组和gp120组分别应用P2Y13激动剂ADP和ADP并P2Y13抑制剂MRS2211处理后，通过酶标仪分析各组细胞内钙离子浓度的变化；（6）免疫荧光法检测各组PC12细胞中P2Y13受体表达情况。 结果：动物实验结果：（1）血压和心率结果显示：gp120组大鼠的血压和心率均较control组升高（Plt;0.01），而应用P2Y13shRNA可抑制gp120处理引起的血压和心率的升高（Plt;0.01），但是NC shRNA没有抑制作用（Pgt;0.05）。心率变异性结果显示：gp120组大鼠LF/HF比值明显高于control组（Plt;0.01），gp120+P2Y13shRNA组大鼠LF/HF比值较gp120组明显降低（Plt;0.01），gp120+NC shRNA组与gp120组相比无明显差异（Pgt;0.05）。（2）心交感神经放电结果显示：gp120组大鼠心交感神经放电幅度较control组明显增强（Plt;0.01），P2Y13shRNA可降低gp120组大鼠心交感神经放电幅度（Plt;0.01），gp120+NC shRNA组与gp120组相比无明显差异（Pgt;0.05）。（3）Real-time PCR结果表明，gp120组大鼠SCG中P2Y13mRNA水平较control组明显升高（Plt;0.001），P2Y13shRNA显著降低gp120组的P2Y13mRNA水平（Plt;0.001），而NC shRNA则无此降低效应（Pgt;0.05）。（4）蛋白印迹结果显示，gp120组大鼠SCG中P2Y13受体、NLRP3炎症小体、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表达水平较control组明显增加（Plt;0.01），P2Y13shRNA显著降低gp120组上述蛋白表达水平（Plt;0.01），而NC shRNA无此降低效应（Pgt;0.05）。（5）免疫荧光结果显示：gp120组大鼠SCG P2Y13受体与NeuN的共表达水平较control组明显增强（Plt;0.01）；与gp120组相比，gp120+P2Y13shRNA组共表达水平降低（Plt;0.01）；gp120+NC shRNA组与gp120组相比无明显差异（Pgt;0.05）。细胞实验结果：（1）CCK-8结果显示，与control组相比，0.2nmol/L浓度的HIV-1gp120对细胞存活无明显影响（Pgt;0.05）；0.4，0.8，1.6nmol/L浓度的gp120组的细胞活力分别是90%，80%，50%；蛋白印迹结果显示当HIV-1gp120处理浓度为0.8nmol/L时，P2Y13受体蛋白表达上升趋势最为明显，因此，我们选定0.8nmol/L作为HIV-1gp120细胞损伤最适建模浓度。（2）Real-time PCR结果表明，gp120组中P2Y13mRNA水平较control组明显升高（Plt;0.01），gp120+P2Y13shRNA组显著低于gp120组（Plt;0.01），gp120+NC shRNA组与gp120组相比无明显差异（Pgt;0.05）。（3）蛋白印迹结果表明，gp120组中P2Y13受体、NLRP3炎症小体、Caspase-1、GSDMD、ASC、IL-1β、IL-18蛋白表达水平较control组明显增加（Plt;0.01），gp120+P2Y13shRNA组中上述蛋白表达水平显著低于gp120组（Plt;0.01），gp120+NC shRNA组与gp120组相比无明显差异（Pgt;0.05）。（4）Elisa检测结果显示：与control组相比，gp120组PC12细胞上清液中IL-1β和IL-18含量增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；gp120+P2Y13shRNA组细胞上清液中IL-1β和IL-18含量与gp120组相比显著下降（P＜0.01）。（5）细胞内钙离子浓度结果显示：与control组相比，gp120组细胞加入ADP后细胞内钙离子浓度明显增加（P＜0.01），P2Y13抑制剂MRS2211可抑制细胞内钙离子浓度升高。（6）免疫荧光结果显示，gp120组P2Y13受体表达水平较control组明显增加（Plt;0.01）；与gp120组相比，gp120+P2Y13shRNA组表达水平降低（Plt;0.01）；gp120+NC shRNA组与gp120组相比无明显差异（Pgt;0.05）。 结论:P2Y13受体参与了gp120所致的心交感神经病变，其分子机制涉及炎性小体NLRP3激活所致的Caspase-1活化、GSDMD形成及炎性因子IL-1β和IL-18的释放这一经典细胞焦亡通路。
颈部交感神经节病变;P2Y13受体;HIV-1包膜糖蛋白gp120;病理变化;分子机制
南昌大学医学部
硕士
基础医学
刘双梅
2022
中文
R745.7;R741.02
2022-11-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）