TGFβ1调控KMT5C-H4K20me3轴对卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响
目的： 阐明卵巢衰老分子机理、建立早期干预策略具有重要现实意义。颗粒细胞是卵巢内重要的体细胞，其增殖和凋亡的失衡是触发卵泡闭锁，并最终导致卵巢早衰或女性不孕的重要原因。本课题拟观察转化生长因子β1（transforming growth factorβ1，TGFβ1）与早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）疾病的相关性，并探索TGFβ1通路对颗粒细胞增殖凋亡的影响以及KMT5C-H4K20me3轴在其中扮演的角色。为完善卵巢衰老的表观遗传机制增添新资料，也为重塑和保护卵巢功能提供潜在的分子靶标。 方法： 1.收取临床早发性卵巢功能不全和卵巢功能正常患者的卵泡液标本，ELISA检测TGFβ1的表达水平，Western blot检测沉淀（主要为颗粒细胞蛋白提取物）TGFβ1蛋白表达量； 2.利用环磷酰胺（120mg/kg）和白消安（30mg/kg）联合腹腔注射建立POI小鼠模型，q-PCR和Western blot检测卵巢TGFβ1表达变化，IHC检测TGFβ1表达定位； 3.分离小鼠卵巢颗粒细胞并进行体外培养，使用TGFβ1小干扰RNA（si-TGFβ1）转染48h后，分别行EDU和FITC/PI双染检测颗粒细胞的增殖和凋亡情况，q-PCR和Western blot检测细胞凋亡相关基因和激素调控酶变化，ELISA测定培养上清Pg、E2和AMH含量； 4.将si-TGFβ1与人卵巢颗粒细胞共孵育48h后，分别行EDU和FITC/PI双染检测颗粒细胞的增殖和凋亡情况，q-PCR和Western blot检测细胞凋亡相关基因和激素调控酶变化，ELISA测定培养上清Pg、E2和AMH含量； 5.Western blot检测si-TGFβ1干扰小鼠颗粒细胞和人KGN细胞后H4K20me3表达变化，同步q-PCR和Western blot检测其调控酶KMT5C的表达变化； 6.KMT5C抑制剂A-196与小鼠颗粒细胞共孵育48h后，Western blot检测颗粒细胞H4K20me3表达变化，并分别使用EDU和FITC/PI双染检测细胞增殖和凋亡情况，q-PCR和Western blot检测颗粒细胞增殖凋亡相关基因和激素调控酶变化，测定培养上清Pg、E2和AMH含量。 结果： 1.ELISA结果显示，较正常组相比，POI患者卵泡液中TGFβ1量显著减少，颗粒细胞沉渣TGFβ1蛋白表达显著减少（P＜0.001）； 2.Q-PCR和WB结果显示，POI小鼠卵巢组织TGFβ1mRNA和蛋白表达亦显著减少（P＜0.01）；IHC结果显示TGFβ1广泛分布于小鼠卵巢组织，且在各级卵泡细胞胞质和胞核上均有表达； 3.EDU显示沉默TGFβ1后颗粒细胞增殖率下降（P＜0.05），FITC/PI双染显示颗粒细胞凋亡增多，q-PCR和WB结果显示Bax/Bcl2蛋白和mRNA水平显著上升（P＜0.05），CYP11a1和CYP19a1mRNA水平显著下降（P＜0.01）；ELISA结果显示颗粒细胞分泌Pg、E2和AMH显著减少（P＜0.05，P＜0.01）； 4.小干扰RNA沉默TGFβ1表达后，EDU显示KGN增殖率下降（P＜0.01），FITC/PI双染显示KGN凋亡增多，q-PCR和WB结果显示Bax/Bcl2蛋白和mRNA水平显著上升（P＜0.05，P＜0.01），CYP11a1和CYP19a1mRNA水平显著下降（P＜0.001），ELISA结果显示，KGN分泌Pg、E2和AMH显著减少（P＜0.05，P＜0.01）； 5.TGFβ1下调后，小鼠颗粒细胞和KGN H4K20me3蛋白表达下降（P＜0.05，P＜0.01），其调控酶KMT5C蛋白和mRNA表达显著下降（P＜0.05，P＜0.01）； 6.A-196抑制KMT5C并下调H4K20me3表达后，EDU显示小鼠颗粒细胞增殖率下降（P＜0.05），FITC/PI双染显示小鼠颗粒细胞凋亡增多，q-PCR和WB结果显示Bax/Bcl2mRNA和蛋白水平显著上升（P＜0.05，P＜0.01），PCNA mRNA和蛋白表达显著上升（P＜0.05，P＜0.01），CYP11a1和CYP19a1mRNA水平显著下降（P＜0.01），ELISA结果显示小鼠颗粒细胞分泌Pg、E2和AMH显著减少（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。 结论： 1.早发性卵巢功能不全与TGFβ1通路异常密切相关； 2.组蛋白翻译后修饰KMT5C-H4K20me3调控轴在卵巢颗粒细胞增殖凋亡及关键激素分泌中起重要调节作用； 3.TGFβ1可能通过KMT5C-H4K20me3轴影响颗粒细胞功能致卵巢早衰。
早发性卵巢功能不全;颗粒细胞增殖;颗粒细胞凋亡;转化生长因子β1;组蛋白甲基转移酶;H4K20me3蛋白;调控机制
南昌大学医学部
硕士
基础医学
郑莉萍
2022
中文
R711.750.23
2022-11-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）