犬尿氨酸羟化酶调控巨噬细胞极化的实验研究
巨噬细胞是异质性的群体，其表型和功能受所处微环境的调控，并与多种疾病的发生与发展存在关联。通常情况下，巨噬细胞主要分化为两个功能异质性的极化群体：经典激活的M1型巨噬细胞和替代激活的M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞可被脂多糖（LPS）、干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子诱导，通过释放多种促炎因子、活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）等发挥促炎活性，有助于内外源性病原体清除，而其长期持续存在可能会导致组织损伤。M2型巨噬细胞通常可被白介素-4（IL-4）、白介素-13（IL-13）等细胞因子诱导，通过分泌白介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）等发挥抑炎作用，并通过促进血管生成等参与组织修复重建。巨噬细胞的极化状态和功能活性与其胞内代谢存在密切关联。作为营养必需氨基酸，色氨酸的代谢方式不仅被发现与肿瘤上皮细胞，也被发现与T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞等免疫细胞的功能活性有关，而其在巨噬细胞中的研究尚不多。因此，本课题以色氨酸代谢作为研究靶向，对其关键酶——犬尿氨酸羟化酶（KMO）调控巨噬细胞极化的作用进行分析，以期为靶向巨噬细胞色氨酸代谢通路的临床疾病诊治提供理论与实验依据。 目的： 探讨犬尿氨酸羟化酶对巨噬细胞极化的影响及其内在机制。 方法： 1、基因表达微阵列数据GSE95405使用R包GEOquery下载，使用R语言完成数据的预处理与注释过程。使用R包limma对GSE95405中M1与M2型巨噬细胞基因表达情况进行差异分析。将差异基因与KEGG数据库色氨酸代谢通路基因集（hsa00380）进行交集，获得M1与M2型巨噬细胞的差异色氨酸代谢基因。 2、培养人传代单核细胞株THP-1，使用PMA（100ng/mL）诱导THP-1细胞为M0型巨噬细胞，显微镜下观察细胞形态变化，细胞免疫荧光检测巨噬细胞分子标志物CD68的表达。将20μg/mL的色氨酸添加至M0型巨噬细胞培养液中，qRT-PCR检测M1型巨噬细胞分子标志物CCL2、CCR7和M2型巨噬细胞分子标志物CD11b、PPARG的表达。 3、使用LPS（100ng/mL）和IFN-γ（20ng/mL）诱导M0型巨噬细胞为M1型巨噬细胞；使用IL-4（25ng/mL）和IL-13（25ng/mL）诱导M0型巨噬细胞为M2型巨噬细胞。qRT-PCR检测M1型巨噬细胞分子标志物CCL2、CCR7、CD80和M2型巨噬细胞分子标志物ARG-1、CD11b、PPARG的表达。qRT-PCR检测色氨酸代谢酶IL4I1、IDO1、IDO2、TDO、KYNU、KYAT3、KMO、QRPT在M1和M2型巨噬细胞中的表达。 4、使用IDO抑制剂NLG919、TDO抑制剂LM10和KMO抑制剂Ro61-8048分别作用于M1型巨噬细胞；qRT-PCR检测M1型分子标志物CCL2、CCR7、CD80的表达；免疫印迹方法分析Ro61-8048处理组P65、pP65、STAT1、pSTAT1的表达。 5、使用KMO靶向的siRNA转染M1型巨噬细胞；qRT-PCR检测KMO的表达；qRT-PCR检测M1型巨噬细胞分子标志物CCL2、CCR7、CD80的表达；流式细胞术检测CCR7阳性细胞比例；免疫印迹方法分析P65、pP65、STAT1、pSTAT1、AhR、ATF4的表达。 6、ELISA方法检测KMO沉默的M1型巨噬细胞上清液中KYN和3-HK的含量。将KYN和3-HK分别处理KMO沉默的M1型巨噬细胞中；qRT-PCR检测M1型巨噬细胞分子标志物CCL2、CD80和M2型巨噬细胞分子标志物PPARG、ARG-1的表达。 结果： 1、生物信息学分析结果显示，GSE95405中共计得到4902个差异探针，其中M1型巨噬细胞中上调2103个，M2型巨噬细胞中上调2799个。GSEA分析发现，色氨酸分解代谢以及犬尿氨酸代谢通路明显富集于M1型巨噬细胞，且IL4I1、IDO1、IDO2、TDO2、KYNU、KYAT3、KMO稳定高表达于M1型巨噬细胞，而QRPT稳定高表达于M2型巨噬细胞。 2、PMA处理THP-1细胞24h后，细胞从悬浮状态转变为贴壁成簇生长状态。细胞免疫荧光结果显示，与对照组比较，PMA处理的THP-1细胞中CD68表达升高（p＜0.05）。在M0型巨噬细胞中添加色氨酸后，与对照组相比，M1型巨噬细胞分子标志物CCL2、CCR7的mRNA表达升高，M2型巨噬细胞分子标志物CD11b、PPARG的mRNA表达降低（p＜0.05）。 3、qRT-PCR结果显示，与对照组比较，使用LPS、IFN-γ诱导的M1型巨噬细胞分子标志物CCL2、CCR7、CD80表达升高，使用IL-4、IL-13诱导的M2型巨噬细胞分子标志物ARG-1、CD11b和PPARG表达升高（p＜0.05）。相比于M2型巨噬细胞，M1型巨噬细胞中的色氨酸代谢酶IL4I1、IDO1、IDO2、TDO、KYNU、KYAT3、KMO表达升高，QRPT表达降低（p＜0.05）。 4、qRT-PCR结果表明，与对照组比较，NLG919、LM10和Ro61-8048处理组中M1型巨噬细胞的标志物分子CCL2、CCR7和CD80的mRNA表达明显下调（p＜0.05），且Ro61-8048处理组下调程度最为明显。免疫印迹结果显示，pP65/P65、pSTAT1/STAT1的比值下降（p＜0.05）。 5、使用KMO靶向的siRNA转染M1型巨噬细胞后，qRT-PCR结果显示，与对照组相比，KMO以及M1型巨噬细胞分子标志物CCL2、CCR7、CD80的表达明显下调（p＜0.05）。流式细胞术检测显示，CCR7阳性细胞比例数减少（p＜0.05）。免疫印迹结果显示，与对照组相比，KMO靶向的siRNA转染组，pP65/P65、pSTAT1/STAT1的比值下降（p＜0.05），核内AhR和ATF4表达升高（p＜0.05）。 6、ELISA结果显示，与对照组比较，KMO靶向的siRNA转染组细胞上清液中KYN水平显著升高，3-HK水平显著降低（p＜0.05）。将KYN处理KMO沉默的M1型巨噬细胞后，M1型巨噬细胞分子标志物CCR7和CD80的mRNA水平明显下调，M2型巨噬细胞分子标志物PPARG的mRNA水平明显上调（p＜0.05）。将3-HK处理KMO沉默的M1型巨噬细胞后，M1型巨噬细胞分子标志物CCR7的mRNA水平明显上调，M2型分子标志物ARG-1和PPARG的mRNA水平明显下调（p＜0.05）。 结论： 1、色氨酸代谢酶在M1和M2型巨噬细胞中存在差异表达。 2、外源性色氨酸可以诱导巨噬细胞M1型极化。 3、犬尿氨酸羟化酶抑制M2型巨噬细胞极化。 4、犬尿氨酸与3-羟基犬尿氨酸影响M1型巨噬细胞极化。
巨噬细胞;极化特性;色氨酸代谢;犬尿氨酸羟化酶;调控机制
南昌大学医学部
硕士
基础医学
罗达亚
2022
中文
R392.12
2022-11-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）