乳腺癌外泌窖蛋白-1诱导肺预转移微环境形成的机制研究
目的： 窖蛋白-1（Caveolin-1，Cav-1)是在乳腺癌原发微环境中起重要作用的细胞膜功能蛋白，其是否通过外泌方式影响肿瘤转移微环境尚没有相关研究。课题组前期细胞水平研究发现Cav-1通过增强肿瘤细胞的干性和EMT促进乳腺癌细胞的转移；同时动物实验发现Cav-1还可通过外泌体方式促进乳腺癌肺转移。本课题拟在前期研究基础上，以预转移微环境塑造为核心，研究乳腺癌来源外泌体是否作为载体运送原发肿瘤微环境中的Cav-1至肺组织形成预转移微环境从而促进肺转移的发生，为探索乳腺癌肺转移的创新诊疗靶点提供理论和实践基础。 方法： 1.探究乳腺癌细胞外泌体源性Cav-1对乳腺癌肺转移的作用。构建细胞模型，提取外泌体进行外泌体的理化特征检测(粒径分析、电镜观察形态以及Western Blot检测外泌体标志蛋白和目的蛋白Cav-1的表达)；Transwell检测MDA-MB-231细胞源性含Cav-1型外泌体对亲代MDA-MB-231细胞和非转移性MCF-7细胞的生物学效应;构建小鼠乳腺癌原位肿瘤模型，观察各组小鼠体内乳腺癌肺转移的情况。 2.研究乳腺癌细胞源性含Cav-1型外泌体驯化肺PMN形成的作用机制。Western Blot和RT-qPCR法检测含Cav-1型外泌体对肺上皮细胞Beas2B的PMN标志基因CCL2、S100a8的表达情况；Western Blot、RT-qPCR以及免疫荧光法检测含Cav-1型外泌体对肺成纤维细胞HFL1中Tn C表达情况；流式细胞术检测含Cav-1型外泌体对巨噬细胞THP-1的M2型（CD68+/CD206+）极化情况。 3.研究乳腺癌细胞源性含Cav-1型外泌体通过转运Tn C和抑制PTEN/CCL2/VEGF-A信号通路促进肺PMN形成的机制。RT-qPCR和Western Blot法检测含Cav-1型外泌体刺激后的肺成纤维细胞HFL1细胞裂解液中Tn C的表达水平，肺巨噬细胞THP-1细胞裂解液中PTEN、CCL2和VEGF-A的表达水平；然后敲除肺成纤维细胞HFL1Tn C基因，RT-qPCR和Western Blot法检测MDA-MB-231细胞来源含Cav-1型外泌体刺激后细胞裂解液中Tn C水平；肺巨噬细胞THP-1转染过表达的PTEN，检测MDA-MB-231细胞来源含Cav-1型外泌体刺激后肺巨噬细胞THP-1中CCL2和VEGF-B的表达水平。 结果： 1.乳腺癌细胞外泌体源性Cav-1促进乳腺癌肺转移 Transwell侵袭与迁移实验结果显示，乳腺癌细胞源性含Cav-1的Exo会增加乳腺癌侵袭性细胞MDA-MB-231细胞与非侵袭性细胞MCF-7的迁移和侵袭能力（p＜0.01）；小鼠乳腺癌原位肿瘤模型结果显示，经含Cav-1的Exo处理的小鼠更容易形成肺转移灶，肺组织切片HE染色镜下可见明显核大深染具有异型核分裂相的癌细胞，部分还看见癌栓；免疫组化结果显示，乳腺癌细胞源性含Cav-1的Exo在体内对肺纤维连接蛋白FN和CD31的表达起促进作用，有利于肺转移灶的形成。 2.乳腺癌细胞源性含Cav-1型外泌体促进肺PMN标志基因的表达 （1）在肺上皮细胞Beas2B中，Western Blot结果显示乳腺癌细胞源性含Cav-1的Exo会增加CCL2的表达，RT-qPCR结果显示乳腺癌细胞源性含Cav-1的Exo会增加S100a8的表达(p＜0.05)； （2）在肺成纤维细胞HFL1中，乳腺癌细胞源性含Cav-1的Exo组ECM组分的表达增加(p＜0.01)，同时免疫荧光的结果显示，乳腺癌细胞源性含Cav-1的Exo组Tn C的表达增加(p＜0.05)； （3）在肺巨噬细胞THP-1中，流式细胞术的结果显示，乳腺癌源性含Cav-1的Exo刺激巨噬细胞THP-1后CD206的表达增加，CD68+/CD206+比例下降（p＜0.05）。 3.乳腺癌细胞源性含Cav-1型外泌体通过转运Tn C和抑制PTEN/CCL2/VEGF-A信号通路促进肺PMN形成 （1）肺成纤维细胞HFL1中，乳腺癌细胞源性含Cav-1的Exo组Tn C的表达水平增高(p＜0.05)。 （2）肺巨噬细胞THP-1中，乳腺癌细胞源性含Cav-1的Exo组CCL2、VEGF-A的表达水平增高，PTEN的表达水平降低(p＜0.05)。 （3）敲除肺成纤维细胞HFL1中Tn C基因和过表达肺巨噬细胞THP-1中PTEN基因：肺成纤维细胞HFL1中，乳腺癌细胞源性含Cav-1的Exo组Tn C的表达水平增高(p＜0.05)；肺巨噬细胞THP-1中，乳腺癌细胞源性含Cav-1的Exo组PTEN的表达水平降低，CCL2、VEGF-B的表达水平增高(p＜0.05); 结论： 1.MDA-MB-231细胞源性含Cav-1型外泌体可使受体细胞MDA-MB-231细胞的侵袭迁移能力增强、使MCF-7细胞获得侵袭迁移能力、加速乳腺癌肺转移的发生。 2.MDA-MB-231细胞来源的含Cav-1型外泌体可促进肺上皮细胞PMN标志基因表达、ECM沉积、巨噬细胞M2型极化。 3.肿瘤上清和乳腺癌细胞源性的包裹Cav-1和Tn C的外泌体可促进肺成纤维细胞Tn C纤维基质的沉积，以及MDA-MB-231源性外泌体中的Cav-1可抑制巨噬细胞内PTEN促进巨噬细胞M2极化及肺组织新生血管生成，形成PMN。
乳腺癌;外泌体;窖蛋白-1;肺预转移微环境
南昌大学医学部
硕士
基础医学
熊丽霞
2022
中文
R737.9;R730.2
2022-11-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）