乳腺癌甘油激酶活性对于染料木素拮抗顺铂化疗效应的影响
作为一种广谱的抗肿瘤药物，顺铂（Cisplatin，CIS）被广泛应用于各种恶性肿瘤的临床治疗当中。顺铂化疗耐药现象的频繁发生严重影响了肿瘤化疗的治疗效果，是亟待解决的临床问题。甘油激酶（Glycerol Kinase，GK）是催化游离甘油磷酸化的关键酶，直接调控细胞对于游离甘油的利用能力。团队前期研究发现在膳食源性染料木素拮抗顺铂化疗的过程中，乳腺癌细胞内GK表达出现显著上调。本研究旨在明确GK在染料木素拮抗顺铂效应过程中所发挥的作用，以期探究乳腺癌甘油酯类代谢对于其化疗药物敏感性的潜在影响。 目的： 1.考察染料木素拮抗顺铂化疗过程中各脂类代谢关键酶表达的变化，筛选其中的关键性靶点与相应关键信号通路，分析GK与顺铂耐药经典点各靶点之间的表达相关性。 2.考察乳腺癌细胞GK蛋白表达水平以及活性的变化。 3.考察乳腺癌细胞GK活性变化对于染料木素拮抗顺铂效应的影响。 4.考察乳腺癌细胞GK活性变化对于顺铂效应的影响。 方法： 1.收集前期乳腺癌动物模型瘤体组织进行RNA-Seq，通过生物信息学分析差异表达基因，分析GK与多个甘油脂类代谢及顺铂耐药经典靶点之间的相关性。注释KEGG通路富集分析筛选关键靶点与信号通路，并利用qRT-PCR方法对关键靶点表达水平的变化进行实验验证。 2.以乳腺癌MCF-7细胞为模型，分别设置空白对照组、顺铂单处理组、染料木素单处理组、顺铂染料木素联用处理组，在染料木素拮抗顺铂化疗过程中通过脂滴特异性Nile red染色考察甘油三酯代谢状况的变化，通过Elisa以及甘油利用能力检测考察GK蛋白表达水平以及活性的变化。 3.利用GK特异性抑制剂1-thiolglycerol，分别设置空白对照组、顺铂单处理组、顺铂染料木素联用处理组、GK抑制剂单处理组、GK抑制剂-顺铂-染料木素联合处理组。通过MTT评估不同组别细胞增殖的水平，Nile red染色考察细胞内脂滴贮存状况，Western Blot检测PCNA、Cleaved Caspase3、pAkt/Akt等重要靶点蛋白水平。 4.利用慢病毒感染，建立GK过表达乳腺癌细胞模型，辅以GK特异性抑制剂1-thiolglycerol，利用空载慢病毒感染和GK过表达慢病毒感染两类细胞模型，分别各自设置空白对照组、顺铂单处理组、GK抑制剂单处理组、GK抑制剂-顺铂联合处理组（共分8组）。以MTT法检测处理后细胞活力变化，流式细胞分析细胞周期分布，Nile red染色考察脂滴贮存情况，甘油含量试剂盒检测甘油代谢情况，Western Blot考察PCNA、Cleaved Caspase3、BAX、pAkt/Akt等蛋白质水平。 结果： 1.经过染料木素拮抗顺铂化疗乳腺癌动物模型移植瘤体RNA-seq分析，我们发现GK等13种甘油脂类代谢关键酶出现显著的表达差异，GK与多个甘油脂类代谢关键酶及顺铂耐药经典信号通路（如PI3K-AKT）相应靶点之间均存在表达水平的高度相关。 2.在染料木素拮抗顺铂化疗的过程中，乳腺癌MCF-7细胞内GK表达水平上调，游离甘油利用能力显著加强，胞内脂滴贮存增多。利用特异性抑制剂下调GK活性后，染料木素所引发的胞内脂滴贮存减少，AKT通路的活化被阻断，细胞增殖以及凋亡两个方面均体现出染料木素拮抗顺铂化疗的效应的减弱。 3.在GK过表达乳腺癌MCF-7细胞模型中，细胞内脂滴贮存能力加强，对于顺铂诱导的增殖抑制以及凋亡诱导效应敏感性下降。而GK特异性抑制剂的应用可以部分恢复细胞对于顺铂抗肿瘤效应的敏感性。 结论： 本论文基于移植瘤样本RNA-seq分析以及一系列细胞实验证实：GK通过调控乳腺癌细胞甘油利用能力以及胞内脂滴贮存状况，不光在膳食源性染料木素拮抗顺铂化疗的过程中发挥着非常重要的作用，还直接影响乳腺癌细胞的顺铂化疗敏感性。基于其对于日常膳食诱导的敏感性，GK可以作为我们利用膳食实现辅助肿瘤化疗的重要潜在靶点之一。
乳腺癌;甘油激酶;染料木素;化疗药物敏感性
南昌大学医学部
硕士
基础医学
胡晓鹃
2022
中文
R737.9;R730.2
2022-11-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）