构建高产水杨酸及其衍生物大肠杆菌研究
水杨酸及其衍生物水杨醇、水杨苷具有抗炎活性和抗氧化活性，广泛应用于食品、药品和美容等领域。传统的制取方法无论是植物提取还是化学合成都存在限制多、耗能大、污染重的问题。利用生物合成技术获得天然水杨酸及其衍生物是一种绿色可持续的替代方案。本研究基于课题组构建的质粒生产水杨酸及其衍生物的研究基础，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在野生型大肠杆菌BW25113/F′的基因组水平上实现代谢通路的调控和异源基因的表达，将水杨酸理论碳收率从0.23g/g葡萄糖提升至0.46g/g葡萄糖，构建了一株具有较高碳收率的高产水杨酸及其衍生物的平台菌株。 首先，为了解决进入莽草酸途径的碳流量低下的问题，用促葡萄糖转运酶(GLF)和介导磷酸化的葡萄糖激酶(GLK)替换了大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖转移酶系统，改造大肠杆菌的中心碳代谢。为了解除莽草酸途径关键酶的反馈抑制，在基因组上整合了抗反馈抑制的aroGfbr，并研究了该关键酶表达量对于水杨酸产量的影响。上述改造中与途径适配的表达量可以促使菌株有效积累莽草酸途径的前体PEP，提升途径整体碳流量，能够不依赖复杂的功能性质粒生产较高水平的水杨酸；随后，整合了多拷贝的异源表达途径基因，在无质粒大肠杆菌中从头合成水杨酸，研究了外源酶的表达量与水杨酸产量的关系；最后，研究了莽草酸途径不同的酶与碳通量的关系和全局调控因子改造对途径的影响，在基因组水平强化莽草酸途径酶，提升了途径整体碳通量，获得一株无质粒摇瓶发酵高产1.73g/L水杨酸的平台菌株，达到了初始菌株的81倍。并基于该菌株在摇瓶中从头合成1.60g/L水杨醇和1.42g/L水杨苷。 本研究基于细菌基因组水平应用了系统的代谢工程策略，获得了一株不依赖于质粒系统，遗传稳定的非缺陷型平台大肠杆菌，该菌株生产水杨酸的理论碳收率提升了100%，实际碳收率在摇瓶中达到0.115g/g葡萄糖。该菌株生长生产性能良好，可作为平台菌株生产更多高附加值的水杨酸及其衍生物。本研究不仅构建了高产水杨酸的平台菌株，也对构建良好性能的大肠杆菌无质粒细胞工厂提供了理论和技术支持。
大肠杆菌;水杨酸;水杨醇;水杨苷
北京化工大学
硕士
化学工程与技术
袁其朋
2022
中文
TQ921
2022-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）