酰基连接酶及转移酶的表达与优化及在酯类合成中的应用
酯类化合物是一类易溶于有机溶剂且在活细胞结构中具有重要作用的物质，在化学、食品和医药中应用广泛，故建立高效、绿色的酯类合成方法一直是研究的热点。以代谢工程为基础，利用微生物生产酯类化合物是一种新的合成途径，而筛选可高效表达的酰基连接酶及转移酶是构建该途径的关键。本论文以大肠杆菌为底盘，运用基于基因工程与发酵工程的联合优化策略，探究了不同来源的酰基连接酶及转移酶的适配表达机制，并结合全细胞催化及基因共表达策略，筛选了可催化合成长链脂肪酸酯，苯甲酸酯结构类似物等产物的两种关键酶。 本文以大肠杆菌为底盘，通过表达不同来源的酰基连接酶及转移酶，探究了两种酶的适配表达机制，获得了可在大肠杆菌中高效表达的酰基连接酶及转移酶。通过调节表达过程中的诱导温度、异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（Isopropylbeta-D-thiogalacyranoside,IPTG）浓度，优化培养基、表达菌株及细胞破碎时参数，筛选表达了Streptomycesgriseus来源的酰基连接酶BafX和Orf3、Arabidopsisa来源的连接酶4CL、Aspergillusterreus来源的连接酶IctA，以及Acinetobacterbaylyi来源的酰基转移酶AtfA、Streptomycesgriseus来源的转移酶Orf2、Allochromatiumvinosum来源的转移酶PhaC，确定了其最佳表达条件。经镍柱纯化后测得酰基连接酶及转移酶的蛋白表达量，并以5,5''-Dithiobis-（2-nitrobenzoicacid）（Ellman）试剂为基础，建立了酰基连接酶的分析方法，测得连接酶BafX、Orf3、4CL、IctA酶活分别为1.53×10-3U/mg，6.06×10-3U/mg，0.79×10-3U/mg，3.40×10-3U/mg。 本文利用基因共表达及全细胞催化策略，筛选了可催化合成长链脂肪酸酯、苯甲酸酯结构类似物等产物的两种关键酶。将高效表达的酰基连接酶及转移酶基因适配组合，分别共转化至大肠杆菌进行表达优化，通过建立全细胞催化体系，分析不同组合催化的产物，发现单表达Acinetobacterbaylyi来源的转移酶AtfA时，可催化生成十六、十八烯酸丁酯，证明了酰基转移酶AtfA具有合成长链脂肪酸的能力。Arabidopsisa来源的酰基连接酶4CL与Acinetobacterbaylyi来源的转移酶AtfA组合时，可催化生成苯甲酸酯结构类似物，证明了酰基连接酶4CL与转移酶AtfA组合具有催化合成芳香族酸醇酯类产物的特性，同时证明了转移酶AtfA催化底物的广泛性，为进一步建立催化合成短链二元酸醇酯的研究奠定了基础。
酰基连接酶;酰基转移酶;全细胞催化;共表达;胞内酯
北京化工大学
硕士
化学工程与技术
邓利
2022
中文
TQ225.24;TQ426.97
2022-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）